基于響應(yīng)面法的醇提取黃芪皂苷工藝的優(yōu)化

趙瑛璐 賈麗艷 郭曉俊 趙書田 梁建萍

1（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）

2（山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

3（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科植物膜莢黃芪的干燥根，是一種常用的中藥材。黃芪味甘，不僅能增強免疫力，還具有補氣固表、托毒生肌、利水消腫的功效。黃芪中含有較為豐富的黃酮、多糖、皂苷、氨基酸、生物堿、有機酸、微量元素以及葉酸、亞油酸、膽堿、甜菜堿、香豆酸等化學(xué)成分，其中黃酮類、多糖類、皂苷類物質(zhì)是主要的天然活性物質(zhì)。黃芪的應(yīng)用前景十分廣闊，目前研制出的黃芪類產(chǎn)品，主要為藥品，包括黃芪注射液、黃芪口服液、黃芪膠囊、復(fù)方黃芪鼻腔噴霧劑等。2020 年，國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布了《關(guān)于對黨參等9 種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點工作的通知》，黃芪在9 種物質(zhì)之列，這標(biāo)志著黃芪有望被納入“藥食同源”目錄。在未來，黃芪的價值會被進一步開發(fā)，以黃芪為原料的食品也可能會逐漸走進大眾視野。

黃芪在我國主要分布在北方地區(qū)，山西、河北、山東、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆等省區(qū)均有分布。由于各地的地理環(huán)境和氣候條件不同，黃芪的質(zhì)地及功效也有區(qū)別，其中，山西渾源黃芪在省內(nèi)外比較有名。渾源黃芪，別名正北芪、恒山黃芪，具有“中國黃芪在山西，渾源黃芪甲天下”的美譽。渾源黃芪具有色澤黃亮、粉大、藥性強、空心小、品種純、無污染等特點。因此，研究渾源黃芪中的功能性物質(zhì)，對其開發(fā)利用具有一定的意義。

黃芪皂苷是黃芪的主要功能成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤、強心、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性，在心血管、消化、泌尿、血液、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮重要作用。目前，從黃芪及其同屬性植物中分離出的三萜皂苷已達40 余種，主要有黃芪皂苷（Ⅰ-Ⅶ）、異黃芪皂苷（Ⅰ、Ⅱ）、乙酰基黃芪皂苷（Cyclocephaloside Ⅱ）、大豆皂苷（TrojanosideA、H）等四大類，總稱黃芪皂苷或黃芪總皂苷。

黃芪皂苷含量是評價以黃芪為主藥或含黃芪的中藥制劑配方質(zhì)量的主要指標(biāo)。渾源黃芪最大的特點是總皂苷含量高。本研究以渾源黃芪為原料，以提取液中黃芪皂苷含量為測定指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面Box-Benhnken 試驗優(yōu)化提取黃芪皂苷的工藝條件，為渾源黃芪在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

渾源黃芪。

1.2 試劑

香草醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司；無水乙醇，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；黃芪總皂苷，分析對照品，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 主要儀器

HH-3A型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；YXQ-LS-75SⅡ-01-00型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；YP6002B型電子天平，上海力辰邦西儀器科技有限公司；SC-3612型低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；超聲波粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 單因素試驗

采用單因素試驗研究乙醇體積濃度、料液比、浸提時間、浸提溫度對提取液中黃芪皂苷含量的影響。

將黃芪清洗烘干后粉碎至40 目。稱取一定量黃芪粉，分別在不同乙醇體積濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），浸提時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）和浸提溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）條件下，浸提黃芪皂苷。將獲得的黃芪浸提液，于3 500 r/min 離心20 min，取上清液，測定黃芪皂苷含量。

1.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪皂苷提取工藝

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、浸提時間（C）、浸提溫度（D）為考察因素，以黃芪皂苷含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進行Box-Behnken 設(shè)計法設(shè)計響應(yīng)面試驗，用Design Expert 8.0.6 進行試驗數(shù)據(jù)分析，進而優(yōu)化黃芪皂苷工藝條件。響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.4.3 對照品溶液的制備

精密稱取5.0 mg 黃芪皂苷標(biāo)準(zhǔn)品置于具塞試管中，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，于超聲波粉碎儀中溶解，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.4 黃芪浸提液的制備

將黃芪清洗烘干后粉碎至40 目，稱取1 g 黃芪粉末于三角瓶中，以單因素設(shè)計的乙醇體積濃度、料液比、提取溫度和提取時間提取黃芪皂苷，3 500 r/min 離心20 min，取上清液，備用。

1.4.5 黃芪皂苷含量測定

采用香草醛一硫酸分光光度法測定。

精密吸取質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL 的黃芪皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，置于具塞試管中，加無水乙醇補足體積至0.5 mL，再分別加入0.5 mL 8 %的香草醛-無水乙醇試液和5.0 mL 72%的硫酸搖勻，立即放入62 ℃恒溫水浴中，保溫20 min，置冷水浴中冷卻至室溫，于540 nm 波長處測吸光度。同時以隨行試劑作空白。

吸取0.2 mL 黃芪浸提液，按照上述方法進行操作，測得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出黃芪浸提液中皂苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

以黃芪皂苷含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。得到黃芪皂苷含量測定的線性回歸方程為：y=4.013 1x+0.003 2，R2=0.999 2。

圖1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 乙醇體積濃度對黃芪皂苷提取效果的影響

乙醇體積濃度對黃芪皂苷提取效果的影響如圖2 所示。

圖2 乙醇體積濃度對黃芪皂苷提取效果的影響

由圖2 可知，隨著乙醇體積濃度的增加，浸提液中黃芪皂苷含量先增大后減小。當(dāng)乙醇體積濃度達到80%時，黃芪浸提液中皂苷含量最高；當(dāng)乙醇體積濃度超過80%時，黃芪浸提液中皂苷含量降低，表明浸提黃芪皂苷的最適乙醇體積濃度為80%。

2.3 料液比對黃芪皂苷提取效果的影響

料液比對黃芪皂苷提取效果的影響如圖3 所示。

圖3 料液比對黃芪皂苷提取效果的影響

由圖3 可知，隨著料液比增加，提取液中黃芪皂苷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)料液比為1：10 時，皂苷含量最高?？赡苁窃黾恿弦罕?，增加黃芪粉末與溶液的接觸面積，有效成分的擴散速率得到提升，料液比為1∶10 時，有效成分析出量最大。料液比繼續(xù)增加，會溶解出更多非黃芪皂苷成分，造成干擾。因此選擇最佳料液比為1∶10。在該比例下，既能保證黃芪皂苷含量最高，又可以有效節(jié)約成本。

2.4 浸提時間對黃芪皂苷提取效果的影響

浸提時間對黃芪皂苷提取效果的影響如圖4所示。

圖4 浸提時間對黃芪皂苷提取效果的影響

由圖4 可知，隨著浸提時間的增加，黃芪皂苷溶解，黃芪皂苷含量增加，但浸提時間繼續(xù)增加，會導(dǎo)致皂苷濃度減少，說明浸提1.5 h 時黃芪皂苷已經(jīng)溶解。繼續(xù)浸提會導(dǎo)致雜質(zhì)增多，影響皂苷含量，導(dǎo)致含量減少。所以最佳浸提時間為1.5 h。

2.5 浸提溫度對黃芪皂苷提取效果的影響

浸提溫度對黃芪皂苷提取效果的影響如圖5所示。

圖5 浸提溫度對黃芪皂苷提取效果的影響

由圖5 可知，隨著浸提溫度的升高，浸提液中黃芪皂苷含量先增加后降低。當(dāng)浸提溫度為50 ℃時，黃芪皂苷的含量高于其他水平的皂苷含量。因此，選擇最佳浸提時間為50 ℃。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

續(xù)表

對表2 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到黃芪皂苷含量與乙醇體積濃度（A）、液料比（B）、浸提時間（C）、浸提溫度（D）的二次方程模型為：皂苷含量為12.15-0.090A-0.063B-0.045C-0.044D +0.11AB+0.031AC-0.051AD-0.12BC+0.023BD-0.066CD-3.83A2-2.04B2-1.11C2-0.47D2。黃芪皂苷響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析見表3。

表3 黃芪皂苷響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析

由表3 方差分析可知，黃芪皂苷含量回歸模型顯著性檢驗P＜0.000 1，模型極顯著；黃芪皂苷含量回歸模型失擬性檢驗P=0.991 9＞0.05，說明方程失擬不顯著。該方程對試驗擬合性較好，模型能夠真實的反映試驗數(shù)據(jù)。決定系數(shù)R2=99.96%，校正決定系數(shù)R2Adj=99.92%，說明模型與實際試驗擬合度良好，可以用來對試驗結(jié)果進行初步的分析預(yù)測。根據(jù)回歸方程的方差分析得知，各因素對黃芪皂苷含量影響的主次順序為乙醇體積濃度＞料液比＞浸提時間＞浸提溫度。一次項A、B，交互項AB、BC 以及二次項A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項C、D 以及交互項CD 對結(jié)果影響顯著，其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

根據(jù)回歸模型，得到最佳的提取條件為：乙醇體積濃度79.82%，料液比1∶9.93，浸提時間1.49 h，浸提溫度49.55 ℃。在此條件下，黃芪皂苷含量理論上為12.16 mg/mL。結(jié)合實際和考慮試驗的局限性，對條件進行完善，選擇乙醇體積濃度80 %，料液比1∶10，浸提時間1.5 h，浸提溫度50 ℃。經(jīng)過3 次重復(fù)試驗驗證，得到黃芪皂苷含量為（12.20±0.047）mg/mL。

各影響因素交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖6。AB、AC、AD、BC 都有明顯交互作用，尤其AB 響應(yīng)面曲線走勢較陡，交互作用較顯著，有明顯最高點和最優(yōu)水平。

圖6 各因素交互作用對黃芪皂苷含量的影響

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定醇提渾源黃芪皂苷最優(yōu)條件為：乙醇體積濃度80%，料液比1∶10，浸提時間1.5 h，浸提溫度50 ℃，得到黃芪皂苷含量（12.20±0.047）mg/mL。該工藝可行性高，操作簡單，以乙醇為溶劑，成本低，可用于渾源黃芪皂苷的提取。以上研究為渾源黃芪皂苷提取及開發(fā)提供了技術(shù)支撐。