逍遙丸對利培酮所致雌鼠高泌乳素血癥抑制作用的機(jī)制研究*

王雪龍 李艷嫣 孟 昆

利培酮二代抗精神病藥物[1]，臨床使用過程中可以引起高泌乳素血癥(Hyperprolactinemia，HPRL)這一不良反應(yīng)[2]，使患者血清中泌乳素(Prolactin，PRL)的含量在40 ng/ml以上[3]。PRL的持續(xù)增高會導(dǎo)致下丘腦-垂體-性腺軸功能失調(diào)，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、不孕不育、乳腺增生、骨質(zhì)疏松等，大大降低了患者的生活質(zhì)量[4，5]。臨床上，溴隱亭和阿立哌唑可以對抗利培酮引起的HPRL，但同時會帶來新的不良反應(yīng)[6，7]。逍遙丸具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、疏肝健脾的功效，可以有效改善月經(jīng)不調(diào)、胸脅脹痛等癥狀。近期有臨床研究提示逍遙丸可以有效緩解利培酮所致女性精神分裂癥患者HPRL[8，9]，但是其作用機(jī)制并不清楚。本研究從表型出發(fā)，觀察了逍遙丸對利培酮所致HPRL 雌性大鼠的血清PRL 水平影響以及垂體中PRL mRNA 和PRL蛋白表達(dá)量的影響，為逍遙丸在抗精神病藥物導(dǎo)致HPRL的治療中提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 SPF級別SD雌性未孕大鼠購于湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心，許可證(SYXK(鄂)2016-0031)，體質(zhì)量193.3～210.6 g。小鼠5只一籠飼養(yǎng)，室溫控制在20～25 ℃，保持12 h晝夜交替，適應(yīng)環(huán)境7 d后用于實驗。所有動物實驗均按照衛(wèi)生部關(guān)于實驗動物的飼養(yǎng)和護(hù)理的國家指南進(jìn)行，并經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會審查并批準(zhǔn)后，根據(jù)機(jī)構(gòu)規(guī)定進(jìn)行實驗。

1.2 方法

1.2.1 實驗藥物與試劑 逍遙丸(批號：國藥準(zhǔn)字Z41021831)，利培酮片(批號: 國藥準(zhǔn)字H20010309)，甲磺酸溴隱亭片(批號：H20160030)，Prolactin ELISA試劑盒(貨號：KE00172)，Prolactin/PRL 特異性抗體 (貨號：ab103617)；SYBR Green qPCR Master Mix(貨號：04913850001)。

1.2.2 主要儀器 熒光定量PCR儀購于美國ABI公司；免疫印跡相關(guān)產(chǎn)品(電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀等)購于美國BioRad公司；Epoch全波長酶標(biāo)儀購于美國BioTek公司；電子天平購于瑞士的梅特勒-托利多公司。

1.2.3 HPRL大鼠模型建立[10]本研究利培酮誘導(dǎo)產(chǎn)生HPRL大鼠，將利培酮按照0.1 mg/kg的劑量每天進(jìn)行口腔灌胃SD大鼠，對照組給與相同體積的生理鹽水。連續(xù) 30 d后，如觀察到大鼠血清中PRL含量大于對照組兩倍，則表明建模成功。

1.2.4 分組與給藥 正常大鼠作為對照組，HPRL大鼠隨機(jī)分為模型組和逍遙丸高、中、低劑量組，每組5只，在實驗過程中，HPRL大鼠按照0.1 mg/kg的劑量每天進(jìn)行口腔灌胃，對照組給與相同體積的生理鹽水。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[11]對小鼠體表面積進(jìn)行換算進(jìn)行逍遙丸藥物干預(yù)，其中正常計量(中劑量)為582.8 mg/kg，高劑量為874.2 mg/kg，低劑量為291.4 mg/kg，連續(xù)給藥30 d。陽性對照組溴隱亭30 微克/只，溶解至生理鹽水進(jìn)行灌胃。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)的檢測

1.2.5.1 血清中PRL含量的測定 大鼠末次給藥2 h后，麻醉后進(jìn)行眼球取血，全血4 ℃靜置30 min后，1 000 g/min于 4 ℃離心10 min，分離得到血清，通過ELISA 測定血清中PRL的含量。

1.2.5.2 大鼠垂體中PRL轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的變化 大鼠末次給藥2 h眼球取血后，將大鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，于冰盒上迅速取出大鼠的垂體并稱重，切取組織的一半加入1 ml Trizol，充分勻漿后，進(jìn)行總RNA的提取，cDNA的反轉(zhuǎn)錄，并通過實時熒光定量PCR檢測。β-Actin看家基因作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt方法來計算組間PRL基因的相對表達(dá)量。引物根據(jù)GeneBank上的序列設(shè)計，由天一輝遠(yuǎn)公司合成。β-Actin(NM_007393)：正向引物：5’-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3’，反向引物：5’-TGCTGGAAG GTGGACAGTGAGG-3’；PRL(NM_011164)：正向引物：5’-CTGGCTACACCTGAA GACAAGG-3’，反向引物：5’-TCACTCGAGGACTGCAC

CAAAC-3’。

1.2.5.3 大鼠垂體中PRL蛋白水平表達(dá)量的變化 大鼠按“1.2.5.2”方式處理，切取垂體組織的一半加入1 ml預(yù)冷的生理鹽水后充分勻漿，離心(4 ℃，12 000 g，30 min)，取上清液，進(jìn)行免疫印跡檢測(Western Blot)。TubulinA作為內(nèi)參，比較不同處理組之間PRL的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 逍遙丸對HPRL模型大鼠血清中PRL含量的影響 對照組大鼠血清中PRL濃度為(56.13±8.07)pg/ml，模型組(利培酮誘導(dǎo)組)大鼠血清中PRL濃度為(146.55±13.44)pg/ml，血清PRL含量是對照組的2.61倍，說明造模成功(P<0.01)。在模型組的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了逍遙丸的藥物干預(yù)，結(jié)果如下：逍遙丸低劑量組大鼠血清PRL濃度為(138.24±20.71)pg/ml，與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；逍遙丸中、高劑量組PRL血清濃度分別為(119.91±9.11)pg/ml和(87.45±10.81)pg/ml，溴隱亭組血清PRL為(69.19±4.33)pg/ml，三組血清PRL含量均低于模型組 (P<0.05)。見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；

2.2 逍遙丸對HPRL模型大鼠垂體中PRL轉(zhuǎn)錄水平與PRL蛋白表達(dá)量的影響 模型組(利培酮誘導(dǎo)組)大鼠垂體中PRL轉(zhuǎn)錄水平高于對照組(P<0.01)；將模型組中的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1.0，與之相比，逍遙丸低劑量組大鼠垂體中PRL轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(0.983±0.107)倍](P>0.05)，逍遙丸中、高劑量組中PRL轉(zhuǎn)錄水平均低于模型組[分別為(0.825±0.081)倍和(0.701±0.040)倍] (P<0.05)。同時，與模型組比較，溴隱亭組大鼠垂體中PRL轉(zhuǎn)錄水平為(0.547±0.083)倍。見圖2。

2.3 逍遙丸對HPRL模型大鼠垂體中PRL蛋白表達(dá)量的影響 從圖3免疫印跡實驗可知，內(nèi)參TubulinA在各組之間的表達(dá)量基本一致。模型組(利培酮誘導(dǎo)組)大鼠垂體中的PRL蛋白表達(dá)量高于對照組(P<0.05)。逍遙丸低劑量組大鼠垂體中PRL蛋白表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而中、高劑量組中PRL蛋白表達(dá)量均低于模型組(P<0.05)。同時溴隱亭組垂體中PRL蛋白表達(dá)量低于模型組(P<0.05)。

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與對照組比較，△P<0.01

注：*表示非特異性條帶

3 討論

目前臨床上主要依賴于西藥治療利培酮所導(dǎo)致的HPRL，如溴隱亭與利培酮聯(lián)合使用，阿立哌唑與利培酮聯(lián)合使用等[12]。這些藥物確實可以降低患者血清中的PRL，但這些藥物會降低利培酮的療效，在使用過程中也會帶來一些新的不良反應(yīng)，甚至?xí)又鼐窦膊“Y狀。因此，利培酮發(fā)揮抗精神分裂癥作用的同時，降低其誘導(dǎo)的HPRL，成為精神分裂癥治療中亟待解決的問題。

近年來，許多學(xué)者運(yùn)用中醫(yī)理論研究抗精神病藥物所致HPRL的病因病機(jī)，并表明中醫(yī)藥治療HPRL有效，可以提高西藥療效，且安全性佳[13，14]。龍膽瀉肝湯通過調(diào)控雌鼠下丘腦和垂體中TGF-β信號通路改善抗精神病藥誘導(dǎo)的HPRL[15]；芍藥甘草湯能有效治療利培酮和奧氮平引起的HPRL，降低患者的血清PRL水平，且未見明顯藥物不良反應(yīng)[16，17]；麥芽不僅可以有效地治療利培酮所致男性HPRL[18]，而且麥芽提取物對于利培酮所致HPRL大鼠模型也有著抑制作用[10]；柴胡調(diào)和湯能改善抗精神病藥物所致HPRL[19]。本研究中的中藥制劑逍遙丸出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓等組成，具有疏肝解郁功能[20]。最近研究表明，逍遙丸對利培酮所致女性精神分裂癥患者HPRL有效，對精神分裂癥臨床癥狀無明顯影響，無明顯不良反應(yīng)[8，9]。但是臨床研究由于樣本量小、研究時間較短、患者個體差異較大；另外，逍遙丸的臨床效果是否通過降低體內(nèi)的高PRL，在何種水平上調(diào)控并不清楚，所以需要在動物水平進(jìn)行實驗研究。在本次HPRL大鼠模型實驗研究中，從血清、轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平首次證明了逍遙丸中劑量組以及高劑量組能夠有效降低HPRL大鼠血清中PRL含量，且高劑量的效果要比中劑量的更加明顯。原因是減少PRL在大鼠垂體mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，這與逍遙丸的臨床治療效果一致，提示逍遙丸可以通過下調(diào)垂體中PRL的表達(dá)量，有效改善抗精神病藥物所致HPRL。

雖然本研究結(jié)果表明逍遙丸可以調(diào)控PRL的表達(dá)，但逍遙丸調(diào)控的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。(1)逍遙丸/散的分子調(diào)控機(jī)制未知。前期研究表明，大鼠服用逍遙丸后，腦區(qū)的一系列基因的表達(dá)水平發(fā)生了顯著性變化，例如HSPA1A[21]、DUSP14[22]、GABRD[23]、Npas2[24]等；并且調(diào)控了ERK/MAPK[25]、JAK/STAT[26]、cAMP/PKA[27]等多條信號通路。遙逍丸降低大鼠垂體PRL的含量是否與這些基因和信號通路之間存在協(xié)同或拮抗的分子調(diào)控，值得進(jìn)一步探究。最近一項研究通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，逍遙丸/散通過調(diào)節(jié)亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的合成以及二元酸、脂肪酸、精氨酸和脯氨酸的代謝發(fā)揮作用[28]，提示未來可以通過轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)手段系統(tǒng)研究逍遙丸/散調(diào)控PRL的作用機(jī)制。(2)逍遙丸/散調(diào)控PRL的活性成分未知。逍遙丸具有比較復(fù)雜的生物活性成分和活性靶點。利用高效液相色譜結(jié)合LTQ-Orbitrap質(zhì)譜，Li N等[29]在逍遙丸中鑒定到芍藥苷、甘草苷、甘草酸、阿魏酸、柴胡皂苷A和C、姜黃素和茯苓醇八種活性化合物。Zhou Y等[30]使用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法鑒定了遙逍丸中的4種成分：Z-藁本內(nèi)酯、棕櫚酸、阿特拉辛內(nèi)酯I和阿特拉辛內(nèi)酯II。Yuan N等[31]利用美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的抗抑郁藥和cMap數(shù)據(jù)庫，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并通過TCMSP網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對149個藥理活性成分進(jìn)行了分類,并預(yù)測了99個抑郁癥相關(guān)靶點。逍遙丸/散中何種活性成分調(diào)控垂體PRL基因的表達(dá)，從而調(diào)控PRL的含量，需要進(jìn)一步研究。

本研究利用HPRL大鼠模型來研究逍遙丸對利培酮所致雌鼠HPRL的抑制作用，促進(jìn)了藥物的作用機(jī)制研究與現(xiàn)實臨床病例研究緊密結(jié)合，但對于逍遙丸作用的分子下游信號通路和靶向機(jī)制有待于深入研究。利用該模型也可以進(jìn)一步研究逍遙丸聯(lián)合其他藥物緩解抗精神病藥物所致HPRL，從而實現(xiàn)更大的臨床現(xiàn)實價值。