圣路易斯腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

姚彥紅吳曉衛(wèi)張偉

(1.甘肅醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，甘肅 平?jīng)?744000；2.深圳市尚維高科有限公司分子生物學(xué)研究室，廣東 深圳 518000)

前言

圣路易斯腦炎病毒(St.Louis encephalitis virus，SLEV)隸屬于黃病毒科(family Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，病毒直徑大小為40～50nm，有表面突起的囊膜和濃集的核心，其基因組為單股正鏈RNA[1]。血清學(xué)分類與日本腦炎病毒、西尼羅熱病毒、墨累谷腦炎病毒等同屬乙型腦炎病毒群[2]。SLEV病毒于1933年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，主要流行于北美洲的密西西比河和俄亥俄河流域等區(qū)域，蟲(chóng)媒是這種病毒的關(guān)鍵傳播載體，容易導(dǎo)致感染者患上頗為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前并無(wú)專門(mén)的疫苗與特效藥[3,4]。

圣路易斯腦炎病尚未在我國(guó)暴發(fā)流行，故國(guó)內(nèi)對(duì)此病原檢測(cè)技術(shù)的研究目前很少，2017年張娜娜等[5]報(bào)道了一種基于制備含SLEV基因的假病毒顆粒的熒光定量PCR檢測(cè)方法用于檢測(cè)圣路易斯腦炎病毒，該方法的最低檢測(cè)限為1.8×103copies·mL-1。但是近些年，國(guó)際交流頻繁度不斷攀升，這意味著這種病毒有較大幾率傳入我國(guó)。為此，開(kāi)發(fā)一種安全有效、簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法對(duì)于該病毒的及時(shí)診斷和防控具有重要意義。

本文主要研究重組質(zhì)粒技術(shù)結(jié)合熒光定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，這種方法憑借其靈敏度高、檢測(cè)快速、特異性高等優(yōu)勢(shì)，在病原的基因表達(dá)水平分析、定量定性檢測(cè)等領(lǐng)域運(yùn)用頗廣[6]。通過(guò)合成含有圣路易斯腦炎病毒的保守靶標(biāo)基因和設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立一種圣路易斯腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試，探究其對(duì)于圣路易斯腦炎病毒的檢測(cè)效果，為相關(guān)部門(mén)或醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)圣路易斯腦炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查和傳染病監(jiān)測(cè)提供一種技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒

重組西尼羅病毒和黃熱病毒購(gòu)自南京賽泓瑞生物科技有限公司，登革熱病毒由江蘇國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心惠贈(zèng)，日本乙型腦炎病毒減毒活疫苗采購(gòu)自成都生物制品研究所，圣路易斯腦炎病毒由本公司提供序列交于南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試劑和儀器

MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、MMLV酶、熒光定量PCR通用試劑盒premix Taq購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。BL21感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I/HindIII/NotI以及高保真酶PrimeSTAR均由NEB生產(chǎn)。pUC57載體及連接試劑盒由北京TIANGEN公司生產(chǎn)。上海華舜生物公司所提供的試驗(yàn)用材分別為膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取、RNA提取試劑盒。本次使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)，對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)是StepOne Software v2.0。

1.3 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì)

由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/)下載多條SLEV的基因序列進(jìn)行反復(fù)比對(duì)分析，選取的圣路易斯腦炎病毒保守NS5基因核苷酸序列(GenBank登錄：KY271953.1)作為靶標(biāo)，利用DNAStar系統(tǒng)開(kāi)展同源性分析，由此篩選出特異核苷酸且高度保守的區(qū)域作為靶標(biāo)區(qū)域合成氨芐抗性的質(zhì)粒序列。在設(shè)計(jì)特異性熒光探針和引物過(guò)程中，使用的系統(tǒng)是Primer Express 5.0，而本次所選用的探針與引物均來(lái)自于南京金瑞斯生物公司，序列詳見(jiàn)表1。

表1 圣路易斯腦炎病毒NS5基因?qū)崟r(shí)RT-PCR檢測(cè)的引物和探針

1.3.2 質(zhì)粒鑒定與DNA核酸標(biāo)準(zhǔn)品制備

質(zhì)粒合成后經(jīng)測(cè)定，濃度為40ng·μL-1(原材料為干粉質(zhì)粒4μg，加入100μL的TE溶液溶解)，拷貝數(shù)為2.99×1011copies·mL-1，測(cè)定方法參考徐珍等研究方法[7]。以10倍梯度稀釋濃度至2.99×102copies·mL-1，取少量各濃度下的質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定，在100～250bp中間均有明顯的條帶。

制備SLEV病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品：-80℃下EP管中保存的BL21感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，吸取濃度為40ng·μL-1的合成質(zhì)粒5μL加入到95μL的BL21感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后,42℃熱休克90s再于冰上放置5min；加入900μL的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；離心后吸取100μL上清液涂布于LA平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2h，取1.5mL的菌液根據(jù)酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物回收進(jìn)行電泳，電泳跑出140bp條帶對(duì)應(yīng)的菌液送上海生工測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的質(zhì)?？寺U(kuò)增作為SLEV病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-NS5，使用質(zhì)粒DNA快速小提試劑盒提取核酸并純化，-80℃保存?zhèn)溆谩：怂針?biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)測(cè)定，濃度為6.61×109copies·mL-1。

1.3.3 樣本RNA提取

采用上海華舜生物技術(shù)有限公司的RNA提取試劑盒提取核酸，具體參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.3.4 Real-time PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

在本次研究中，模板使用的是稀釋的重組質(zhì)粒，獲取的指標(biāo)主要是最高熒光增量值與最小Ct值，通過(guò)矩陣法分別對(duì)探針濃度(0.2～2μM)及探針濃度(0.1～1μM)加以優(yōu)化，然后基于RT-PCR反應(yīng)條件，選用最優(yōu)的退火溫度來(lái)對(duì)濃度一致的重組質(zhì)粒加以檢測(cè)，這個(gè)溫度區(qū)間在55～65℃。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與結(jié)果判定

以質(zhì)粒為對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋，使之為2.99×1010～29.9×100copies·mL-1，在最優(yōu)反應(yīng)環(huán)境下進(jìn)行擴(kuò)增，完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。判定為陽(yáng)性的條件為熒光強(qiáng)度增加值達(dá)到陰性對(duì)照3倍，同時(shí)循環(huán)閾值不超過(guò)40(含)，否則就可以將其判定為陰性。

1.3.6 特異性試驗(yàn)

依次采用重組西尼羅病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒減毒活疫苗，以pUC57-NS5重組質(zhì)粒為模板，完成RT-PCR擴(kuò)增，由此對(duì)本試驗(yàn)方法的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 敏感性試驗(yàn)

以FBS將SLEV病毒核酸重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-NS5進(jìn)行10倍梯度稀釋至6.61×101copies·mL-1，依次提取DNA與反轉(zhuǎn)錄cDNA，完成靈敏度檢測(cè)。

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

以相同樣品為對(duì)象，基于一致性的條件，完成5次組間、組內(nèi)試驗(yàn)，完成本次試驗(yàn)方法重復(fù)性檢測(cè)。

1.3.9 檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

從甘肅、新疆、內(nèi)蒙等地牧場(chǎng)采集蚊蟲(chóng)27份，從大連、天津、廈門(mén)、深圳等沿海港口城市郊區(qū)使用誘蚊燈捕捉蚊蟲(chóng)49份，共計(jì)檢測(cè)蚊蟲(chóng)樣品66份，將所有的蚊蟲(chóng)研磨處理之后，取其中10份分別加入等量SLEV病毒核酸重組質(zhì)粒(濃度為6.61×106copies·mL-1)，提取核酸圣路易斯腦炎病毒檢測(cè)。產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒鑒定

質(zhì)粒經(jīng)過(guò)稀釋后進(jìn)行凝膠電泳鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示，目的條帶約為140bp，與預(yù)期的長(zhǎng)度大小一致，見(jiàn)圖1。

圖1 質(zhì)粒電泳鑒定結(jié)果

2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

優(yōu)化探針、引物的退火溫度、濃度等參量，獲得最優(yōu)RT-PCR反應(yīng)體系：模板5μL，上/下游引物SLEV 3341Fp/SLEV 3480Rp (10pmol·μL-1)分別為1.5μL、TaqMan探針SLEV3380Probe(10pmol·μL-1)0.8μL、2×Premix Taq 12.5μL、MMLV酶(5U·μL-1)0.2μL、ddH2O 3.3μL、ROX Reference Dye(50×)0.2μL。具體反應(yīng)條件：50℃15min，95℃ 5min，95℃ 15s，60℃30s、65℃ 30s，45個(gè)循環(huán)。60℃30s完成FAM熒光信號(hào)的采集。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以陽(yáng)性重組質(zhì)粒為對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行10倍稀釋，然后將其用作模板并進(jìn)行擴(kuò)增，由此便能獲得動(dòng)力學(xué)曲線，其濃度為2.99×1010～29.9×100copies·mL-1，擴(kuò)增效率與R2值分別為94.25%和0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.4678x+44.682,具體可參見(jiàn)圖2。

圖2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性測(cè)試

依次選用SLEV病毒重組質(zhì)粒pUC57-NS5、重組西尼羅病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒減毒活疫苗核酸用作模板，得到的擴(kuò)增結(jié)果為陰性，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增情形，意味著此方法擁有頗佳的特異性。

圖3 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

2.5 敏感性測(cè)試

將濃度為6.61×109copies·mL-1的SLEV病毒核酸重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-NS5進(jìn)行10倍梯度稀釋至6.61×101copies·mL-1，將濃度6.61×108copies·mL-1、6.61×107copies·mL-1、6.61×106copies·mL-1、6.61×105copies·mL-1、6.61×104copies·mL-1、6.61×103copies·mL-1、6.61×102copies·mL-1、6.61×101copies·mL-1的稀釋樣品分別提取DNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。結(jié)果顯示，最低可檢測(cè)到濃度為6.61×102copies·mL-1的SLEV病毒核酸重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

圖4 熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性測(cè)試

通過(guò)重復(fù)性擴(kuò)增試驗(yàn)，能夠獲得Ct值變異系數(shù)不超過(guò)1.5%，這意味著RF-PCR檢測(cè)法具有較佳的可重復(fù)性，同時(shí)也有頗高的穩(wěn)定性，詳細(xì)數(shù)據(jù)可參見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

對(duì)采集的66份蚊蟲(chóng)樣品經(jīng)過(guò)檢測(cè)均為圣路易斯腦炎病毒陰性；加入SLEV病毒核酸重組質(zhì)粒的5份蚊蟲(chóng)樣品檢測(cè)結(jié)果為圣路易斯腦炎病毒陽(yáng)性，擴(kuò)散產(chǎn)物經(jīng)過(guò)上海生工測(cè)序結(jié)果一致；單獨(dú)圣路易斯腦炎病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。

圖5 檢測(cè)方法的應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

3 討論

SLEV自1932年夏天在美國(guó)伊利諾伊州首次暴發(fā)流行，1933年夏天在密蘇里州的圣路易斯暴發(fā)流行病例達(dá)到1000人，據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，圣路易斯腦炎僅在北美地區(qū)流行[8]。人類是目前已知的自然感染該圣路易斯病毒后致病的唯一宿主，感染后可使人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，嚴(yán)重者甚至死亡，且高齡是病死的高危因素，成人感染病死率10%～25%[9,10]。目前并無(wú)圣路易斯病毒感染針對(duì)性治療藥物，結(jié)合當(dāng)前世界人民全球性流動(dòng)可能導(dǎo)致圣路易斯腦炎在國(guó)內(nèi)傳播流行，所以，想要更好地做好疫情篩查與控制工作，就必須要?jiǎng)?chuàng)建早起快速診斷體系。圣路易斯腦炎病毒作為可感染人類且致病的病原，運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)具有實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的特點(diǎn)，本次成功完成RF-PCR檢測(cè)法的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，為這種病毒的監(jiān)測(cè)與檢測(cè)提供了更為快速、特異與靈敏的方法。使用本方法對(duì)采集的66份蚊蟲(chóng)樣品和5份加入SLEV病毒核酸重組質(zhì)粒的蚊蟲(chóng)樣本進(jìn)行檢測(cè)，在66份蚊蟲(chóng)樣本中未檢測(cè)出圣路易斯腦炎病毒的陽(yáng)性，混合有SLEV病毒核酸樣品中檢測(cè)出圣路易斯腦炎病毒的陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明本研究方法在臨床樣品檢測(cè)上結(jié)果準(zhǔn)確，陽(yáng)性檢出率為100%。

本研究運(yùn)用生物學(xué)軟件反復(fù)對(duì)比分析圣路易斯腦炎病毒的基因序列，在確定以其保守片段NS5基因作為靶標(biāo)后，設(shè)計(jì)引物和熒光探針，使用合成重組質(zhì)粒樣品，按照正交試驗(yàn)方法對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，成功開(kāi)發(fā)了SLEV病毒的RF-PCR檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)本次所提供的檢測(cè)方法對(duì)圣路易斯腦炎病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性檢測(cè)，結(jié)果顯示，最低可檢測(cè)到濃度為6.61×102copies·mL-1。特異性試驗(yàn)表明，建立的方法對(duì)于黃病毒屬的其它病原不存在非特異性擴(kuò)增情況，完全可以針對(duì)圣路易斯腦炎病毒的鑒別檢測(cè)。重復(fù)性測(cè)試表明，該方法檢測(cè)的變異系數(shù)小于1.5%，檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。

綜上所述，本研究建立的圣路易斯腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法能夠運(yùn)用于對(duì)圣路易斯腦炎病毒的檢測(cè)，該方法可以為圣路易斯腦炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查和傳染病監(jiān)測(cè)提供一種技術(shù)基礎(chǔ)，便于醫(yī)院、疾控和相關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)更好地應(yīng)對(duì)疾病和疫情的診斷和監(jiān)測(cè)。