二甲雙胍干預(yù)FFA 誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的IR及β 細(xì)胞凋亡的機制研究*

蘇曉萍 李慶鈴 曾紀(jì)斌 梁奇 曹麗萍

（廣東省深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院 深圳 518133）

2 型糖尿病為嚴(yán)重糖脂代謝紊亂綜合征，而患者胰腺β 功能障礙與2 型糖尿病發(fā)生關(guān)系密切[1]。研究顯示游離脂肪酸（Free Fatty Acid,FFA）與高血糖誘導(dǎo)胰腺組織內(nèi)部活性氧大量形成相關(guān)，會導(dǎo)致其內(nèi)部抗氧化-氧化平衡被打破，氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活而造成胰腺細(xì)胞凋亡發(fā)生，使胰腺β 細(xì)胞功能損傷，進(jìn)而加重糖尿病病情[2～3]。胰腺β 細(xì)胞內(nèi)部存在豐富內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而FFA 及高糖會造成胰島素大量分泌，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，進(jìn)一步加重胰腺β 細(xì)胞功能障礙及糖尿病病情[4]。二甲雙胍可以有效減輕2型糖尿病患者胰島素抵抗，糾正機體糖代謝紊亂，目前已明確其對于2 型糖尿病糖代謝的改善主要經(jīng)減輕炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用[5～6]，但是其是否可以經(jīng)由糾正胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而減輕2 型糖尿病胰島素抵抗，保護胰腺β 細(xì)胞尚需要進(jìn)一步研究證實?；诖?，本研究以FFA 構(gòu)建2 型糖尿病大鼠模型，隨后應(yīng)用二甲雙胍注射，明確其對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗與β 細(xì)胞凋亡的影響作用機制，為后期2 型糖尿病防治提供參考意見。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 鹽酸二甲雙胍緩釋片（注冊證號H20170029），胰島素（國藥準(zhǔn)字H32024567），血糖、胰島素試劑盒（購自ALPCO 公司），Trizol 試劑、信使核糖核酸（Messenger RNA,mRNA）抽提試劑盒（購自賽默飛世爾科技公司），ECL 顯色盒（購自美國Abbkine 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），脫脂奶粉（購自美國BD 公司），兔抗大鼠磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated Protein Kinase B,p-AKt）、蛋白激酶B（Akt）、胰島素受體β（Insulin Receptor β,IRβ）一抗（購自英國Abcam 公司），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗（購自上海碧云天生物科技有限公司）。

1.1.2 儀器 Accu-Chek Active 型羅氏血糖儀（購自羅氏血糖醫(yī)護公司），1650-W 型普通臺式離心機（購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），D5100型數(shù)碼相機（購自日本尼康公司），702 型冰箱、2K15型臺式高速冷凍離心機（購自美國Thermo 公司），TKD-TSB 型組織脫水機（購自湖北康強醫(yī)療器械有限公司），TB-718D 型石蠟包埋機（購自湖北泰維科技實業(yè)有限公司），RM2235 型石蠟切片機（購自徠卡顯微系統(tǒng)有限公司），CX41 型號正置顯微鏡（購自日本奧林巴斯有限公司），041BR120387 型電泳儀以及其他相關(guān)設(shè)備（購自美國Bio-Rad 公司）；Elx800 型號酶標(biāo)儀（購自BioTek 公司），ProFlex 型PCR 系統(tǒng)（購自賽默飛世爾科技公司）。

1.1.3 動物 SPF 級雄性大鼠購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，編號SCXK（粵）2020-0055，飼養(yǎng)于廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司動物房，編號SYXK（粵）2020-0242，大鼠一共70 只，周齡為7～8周，可以自由飲食進(jìn)水。

1.1.4 TBST 溶液配置 稱量氯化鈉（NaCl）8 g 與氯化鉀（KCl）0.5 g，同時量取三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（tris-HCl）（1M，pH 7.5）50 ml 以及吐溫0.5 ml，將其混合后加水定容到1 L。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 大鼠在動物房應(yīng)用正常飼料至14 周齡，選擇其中50 只大鼠應(yīng)用含有20%FFA 飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4 周后選擇高血脂大鼠在尾靜脈注射25 mg/m2鏈脲霉素，1 周后測定尾靜脈血糖，隨機血糖水平超過16.7 mmol/L 顯示2 型糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功[7]，最終建模成功大鼠43 只。隨后選擇其中40 只按照大鼠胰島素耐量、空腹血糖情況進(jìn)行胰島素給藥，給藥40 min 后依據(jù)大鼠體質(zhì)量、三酰甘油、血糖下降百分?jǐn)?shù)、膽固醇均勻分為模型組與二甲雙胍組，二甲雙胍組每天注入200 mg/kg 二甲雙胍，取未進(jìn)行建模剩下的20 只作為空白對照組，大鼠應(yīng)用正常飼料喂養(yǎng)，空白對照組、模型組則注入與二甲雙胍等體積的生理鹽水，連續(xù)用藥58 d，但是從用藥第1 天起每隔3 d 測定1 次體質(zhì)量。

1.2.2 糖代謝情況評估 在給藥49 d 時大鼠正常飲水，禁食12 h，采集尾尖靜脈血10 μl，測定空腹血糖、空腹胰島素，餐后1 h 與2 h 血糖，空腹血糖、胰島素水平。胰島素水平應(yīng)用葡萄糖氧化酶法測定，依據(jù)空腹血糖與空腹胰島素計算胰島素抵抗[8]，胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mIU）/22.5。新β 細(xì)胞功能指數(shù)（Modified β-Cell Function Index,MBCI）=（空腹血糖×空腹胰島素）/（餐后2 h 血糖+餐后1 h 血糖－7.0）。

1.2.3 動物實驗與取材 所有大鼠給藥52 d 后，三組大鼠每組再均分為4 組份，分別用于進(jìn)行胰腺形態(tài)、胰腺β 細(xì)胞凋亡、胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)mRNA、胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)分析。

1.2.4 胰腺形態(tài)分析 大鼠處死，分離胰腺后采用生理鹽水進(jìn)行沖洗，大鼠胰腺組織擦干后需要應(yīng)用Bourin's 溶液固定胰尾，隨后進(jìn)行石蠟包埋，進(jìn)行切片后行蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin Staining,HE），并在顯微鏡下拍片觀察。

1.2.5 β細(xì)胞凋亡分析 分離胰腺組織進(jìn)行石蠟包埋切片，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal-deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL）進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察β 細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞核經(jīng)HE 染色后顯示為藍(lán)色，二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-Diaminobenzidine,DAB）顯色凋亡細(xì)胞核顯示為棕黃色，拍片后每份樣品需要選擇6 個視野，β 細(xì)胞凋亡率選擇Image J 軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞凋亡率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)mRNA 測定 收集各組胰腺組織100 mg，應(yīng)用Trizol 試劑進(jìn)行胰腺組織裂解后獲得mRNA，應(yīng)用A260/A280 比值范圍為1.7～2.1 顯示RNA 純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。目的基因擴增以兩步法進(jìn)行，在95℃進(jìn)行預(yù)變性30 s，95℃、60℃分別進(jìn)行5 s、31 s，一共進(jìn)行40 個循環(huán)。測定每個目標(biāo)基因循環(huán)閾值（Cycle Threshold,Ct），按照2-ΔΔCt（注：ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組）計算目標(biāo)基因表達(dá)情況，目標(biāo)基因有免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Immunoglobulin Heavy Chain Binding Protein,Bip）、CCAAT/ 增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding Protein Homologous Protein,CHOP）。見表1。

表1 引物序列

1.2.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白測定 應(yīng)用蛋白印跡法測定大鼠胰腺組織p-AKt、Akt、IRβ 蛋白水平。處死大鼠獲得胰腺組織100 mg，應(yīng)用BCA 蛋白試劑盒測定樣品蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白樣品濃度，依據(jù)相關(guān)配置制備分離膠及濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。獲得硝酸纖維素膜（NC）后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。用5%脫脂牛奶在搖床上封閉處理120 min，隨后加入含有5%脫脂牛奶進(jìn)行相應(yīng)一抗處理，將其置于4℃冰箱內(nèi)搖床上過夜處理。第2 天則加入對應(yīng)二抗，室溫環(huán)境下進(jìn)行120 min 孵育。TBST 溶液完全洗膜處理后需要采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，最后應(yīng)用Image J 軟件對樣品蛋白灰度進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠糖代謝指標(biāo)水平比較 模型組與二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量、MBCI 均顯著低于空白對照組（P＜0.05），空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR 均顯著高于空白對照組（P＜0.05）；二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量、MBCI 均顯著高于模型組（P＜0.05），空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR 均顯著低于模型組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 三組大鼠糖代謝指標(biāo)水平比較

2.2 三組大鼠胰腺組織HE 染色形態(tài)分析 HE 染色結(jié)果顯示，相對于空白對照組，模型組大鼠胰腺組織中存在血腫、脂肪空泡，同時可見一定炎癥浸潤，其邊界不規(guī)則；二甲雙胍組大鼠胰腺組織血腫、囊腫、脂肪空泡均顯著縮小，形態(tài)則變?yōu)橐?guī)則化。見圖2。

圖2 大鼠胰腺組織HE 染色形態(tài)分析

2.3 三組大鼠胰腺β 細(xì)胞凋亡率比較 模型組與二甲雙胍組大鼠胰腺β 細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二甲雙胍組大鼠胰腺β 細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3～4。

圖3 三組大鼠胰腺β 細(xì)胞凋亡率比較

圖4 大鼠胰腺β 細(xì)胞TUNEL 染色分析

2.4 三組大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)mRNA 水平比較 模型組與二甲雙胍組大鼠Bip、CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)mRNA 水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二甲雙胍組大鼠Bip、CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)mRN 水平均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 三組大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)mRNA 水平

2.5 三組大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)蛋白表達(dá)水平比較 模型組與二甲雙胍組大鼠p-AKt、Akt、IRβ 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)蛋白表達(dá)水平均顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二甲雙胍組大鼠p-AKt、Akt、IRβ 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)蛋白表達(dá)均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 三組大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究中應(yīng)用FFA 飼料和鏈脲霉素注射構(gòu)建2 型糖尿病大鼠模型，與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、MBCI 均下降，而空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR 均上升，顯示模型組大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗，胰腺β 分泌功能障礙，表明2 型糖尿病建模成功。

二甲雙胍是治療2 型糖尿病的常規(guī)藥物，可以經(jīng)由調(diào)節(jié)胰島素信號通路改善高糖脂紊亂所致胰島素抵抗，提高肝臟胰島素敏感性，糾正異常血糖水平[9]。本研究中模型大鼠經(jīng)二甲雙胍處理后，大鼠胰島素抵抗減輕，胰腺β 分泌功能障礙情況減輕，胰腺β細(xì)胞凋亡減少，顯示二甲雙胍確實可以有效減輕FFA 所致胰島素抵抗，糾正大鼠脂代謝紊亂，保護胰腺β 細(xì)胞功能。轉(zhuǎn)錄激活因子6（Activating Transcription Factor 6,ATF6）、肌醇需求激酶1α（Inositol-Requiring Enzyme 1α,IRE1α）及蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like ER Kinase,PERK）共3 條信號通路，短時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會有減輕細(xì)胞內(nèi)折疊蛋白異常堆積壓力，而長時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機體器官功能損傷[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，ATF6、IRE1α、PERK3 與Bip 解離，導(dǎo)致其下游相關(guān)信號激活；CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶蛋白，其在正常狀態(tài)下低表達(dá)，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后異常高表達(dá)[11]，因此模型組與二甲雙胍組Bip、CHOP mRNA 水平均上升，而相對于模型組，二甲雙胍組上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)mRNA 水平降低，表明FFA 確實可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，應(yīng)用二甲雙胍處理可以有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活。2 型糖尿病大鼠體內(nèi)CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中細(xì)胞凋亡特異性途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激嚴(yán)重則CHOP 過表達(dá)，其經(jīng)由線粒體途徑促進(jìn)β 細(xì)胞凋亡，另一方面還可以經(jīng)由調(diào)節(jié)抗凋亡和促凋亡蛋白表達(dá)水平而影響大鼠胰腺β細(xì)胞功能[12]。國外研究認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)由上調(diào)CHOP 水平而導(dǎo)致2 型糖尿病發(fā)生，而將CHOP 基因敲除后胰島β 細(xì)胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激敏感性下降，對于2 型糖尿病具有顯著延緩作用[13]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與2 型糖尿病胰島素異常關(guān)系密切，而其具體作用機制尚需要進(jìn)一步研究證實。Akt 在胰島β 細(xì)胞信號交聯(lián)中相對復(fù)雜，但是胰島素高水平所致Akt 磷酸化可以反映胰島素信號活化情況[14]。本研究中二甲雙胍組大鼠p-AKt、Akt、IRβ 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)蛋白表達(dá)均顯著高于模型組，顯示二甲雙胍可以有效調(diào)節(jié)p-AKt、Akt、IRβ 蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而影響PI3K-Akt 信號通路。動物研究中2 型糖尿病小鼠應(yīng)用雙環(huán)醇處理后經(jīng)由胰島素信號通路磷酸化，上調(diào)p-IRβ/IRβ、p-Akt/Akt 而增強胰島素信號通路，促進(jìn)雙環(huán)醇對于2 型糖尿病降糖以及胰島素增敏作用[15]。本研究中二甲雙胍對于FFA 誘導(dǎo)2 型糖尿病胰島素抵抗具有顯著抑制作用，對于胰島β 細(xì)胞具有明顯保護作用，其主要經(jīng)由調(diào)節(jié)Bip、CHOP 等相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激mRNA 水平，進(jìn)而上調(diào)p-AKt、Akt、IRβ 蛋白表達(dá)水平，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激紊亂，糾正糖代謝紊亂。李敏慧等[16]研究也顯示胰島素抵抗大鼠應(yīng)用電針處理后Akt、IRβ 水平均顯著改善，顯示電針可以有效改善IRβ 活性，上調(diào)p-AKt 水平，改善下游靶基因轉(zhuǎn)錄，減輕大鼠胰島素抵抗，也證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激mRNA 級相關(guān)蛋白參與介導(dǎo)了胰島素抵抗過程。

綜上所述，二甲雙胍可以有效減輕FFA 誘導(dǎo)所致胰島素抵抗，減少胰島β 細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA 表達(dá)，上調(diào)胰島素信號通路p-AKt、Akt、IRβ 蛋白水平有關(guān)。