松果菊苷對(duì)嚴(yán)重?zé)齻笫蠹毙阅I損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

李 露,劉曉茜,王清艷,魏 茹

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:liluxayxy@163.com)

重度燒傷可導(dǎo)致多種全身性的并發(fā)癥,包括全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征等[1]。腎臟是燒傷后極易受累的靶器官之一,急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)也是重度燒傷后常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]。燒傷后早期AKI的發(fā)生與患者的預(yù)后緊密相關(guān),發(fā)生早期AKI的重度燒傷患者往往預(yù)后較差且死亡率較高[3]。因此,對(duì)于燒傷后早期AKI的預(yù)防和干預(yù)是改善重度燒傷患者預(yù)后、降低死亡率的關(guān)鍵。近年來,關(guān)于嚴(yán)重?zé)齻翧KI的病理生理機(jī)制仍未完全闡明,越來越多的證據(jù)表明炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡在其發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4,5]。

松果菊苷(echinacoside, ECH)是從管花肉蓯蓉植物中提取的一種天然苯乙醇苷類化合物,已被報(bào)道具有多種生物活性,如抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),ECH具有顯著的腎臟保護(hù)作用[7-9],我們課題組前期研究也觀察到ECH可以明顯減輕膿毒癥小鼠急性腎損傷[10]。然而,ECH能否保護(hù)腎臟免受嚴(yán)重?zé)齻碌腁KI及其具體機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過背部燙傷法構(gòu)建重度燒傷模型,探討ECH對(duì)嚴(yán)重?zé)齻驛KI的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只,8周齡,由西安醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。松果菊苷(echinacoside, ECH)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。SIRT3通路抑制劑3-TYP購(gòu)自美國(guó)GlpBio公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),丙二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。SIRT3、gp91phox、cleaved Caspase-3和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組處理 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為4組:假燒傷組(sham)、燒傷組(burn)、燒傷+松果菊苷處理組(burn+ECH)和燒傷+松果菊苷處理+抑制劑組(burn+ECH+3-TYP)。燒傷大鼠模型建立如下[11]:SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,背部脫毛仰臥位固定于中空的特制燒傷裝置上,僅將大鼠背部沉浸到100 ℃的熱水中15 s,以造成30%體表面積全層皮膚Ⅲ度燒傷模型。術(shù)后各組大鼠腹腔注射5 ml/kg的乳酸林格液復(fù)蘇補(bǔ)液治療,同時(shí)術(shù)后即刻給予大鼠皮下注射0.25 mg/kg丁丙諾啡鎮(zhèn)痛,且每隔12 h給予一次維持鎮(zhèn)痛治療。假燒傷組大鼠經(jīng)麻醉后將其沉浸到25 ℃的溫水中15 s,余步驟與燒傷組相同。burn+ECH組和burn+ECH+3-TYP組大鼠在燒傷后0 h和6 h給予腹腔注射ECH(100 mg/kg)藥物處理2次,且burn+ECH+3-TYP組大鼠在給藥處理的同時(shí)給予3-TYP(50 mg/kg)腹腔注射。各組大鼠于處理完成后48 h經(jīng)戊巴比妥鈉過量麻醉后取材。

1.2.2 腎功能測(cè)定 采集大鼠血樣,以3 000 r/min離心10 min獲得血清樣本,用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和血肌酐(serum creatinine, Cr)的水平。

1.2.3 HE染色觀察腎組織損傷情況 大鼠腎標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋后切成3 μm厚的切片。切片在脫蠟后用HE染色。如文獻(xiàn)[12]所述,對(duì)腎組織學(xué)改變進(jìn)行評(píng)分。每片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行盲法觀察。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平 測(cè)定炎癥因子白細(xì)胞介素1-β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá)以評(píng)價(jià)腎臟組織的炎癥反應(yīng)狀態(tài)。用TRIzol試劑從組織中分離總RNA,逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)生成cDNA。用BIO-RAD分光光度法測(cè)定RNA和cDNA的濃度和純度。引物采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì),由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成。在iQTM5 RT-PCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt法對(duì)靶基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。引物序列信息見表1。

表1 相關(guān)炎癥因子引物序列

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)腎組織NF-κB表達(dá)情況 將前述制備好的石蠟切片脫蠟后,在NF-κB抗體中4 ℃孵育24 h,PBS洗滌切片后用DAPI染細(xì)胞核,隨機(jī)取5個(gè)高倍視野觀察進(jìn)行盲法觀察,用Image Pro圖像分析軟件分析免疫熒光染色圖。

1.2.6 試劑盒測(cè)定腎組織MDA、SOD和GSH-Px水平 測(cè)定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px),以評(píng)價(jià)腎臟組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。各組腎組織勻漿按照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒說明書反應(yīng)后,用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度值以計(jì)算組織MDA、SOD和GSH水平。

1.2.7 TUNEL染色檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡情況 將前述制備好的石蠟切片按照TUNEL檢測(cè)試劑盒染色后在顯微鏡下觀察和拍照,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行盲法觀察。DAPI染色的每一個(gè)陽(yáng)性點(diǎn)均作為一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù),與之重疊的綠點(diǎn)計(jì)數(shù)為凋亡細(xì)胞,用盲法測(cè)定凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比值來確定凋亡指數(shù),進(jìn)而反應(yīng)腎組織細(xì)胞凋亡程度。

1.2.8 Western blot檢測(cè)SIRT3、gp91phox、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在37 ℃下封閉膜2 h,用特異性SIRT3(1 ∶1 000)、gp91phox(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)一抗孵育24 h。然后用相應(yīng)的酶標(biāo)山羊抗兔(1 ∶4 000)二抗在37 ℃下孵育膜1 h。用ECL發(fā)光液并通過Bio-Rad系統(tǒng)成像,觀察膜上的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參,Image Lab軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0程序進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能比較及腎組織形態(tài)學(xué)改變

檢測(cè)大鼠腎功能指標(biāo)顯示,與sham組相比,burn組大鼠血清中BUN和Cr含量明顯上升(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠血清中BUN和Cr含量均顯著降低(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠血清中BUN和Cr含量又明顯上升(P<0.05,見圖1)。大鼠腎組織HE染色結(jié)果顯示,sham組大鼠腎組織形態(tài)清晰、正常,無病理?yè)p傷;burn組大鼠腎臟可見腎小球體積增大,腎小管腫脹、壞死伴空泡樣變性,并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腎組織損傷評(píng)分明顯升高;burn+ECH組大鼠腎組織病理?yè)p傷明顯減輕,腎組織損傷評(píng)分顯著降低;而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織病理?yè)p傷明顯加重,腎組織損傷評(píng)分又顯著升高(見圖1)。

圖1 各組大鼠的腎組織結(jié)構(gòu)及腎功能比較 (×400)Figure 1 Comparison of renal tissue structure and renal function between groups (×400)

2.2 各組大鼠腎組織炎癥反應(yīng)水平比較

RT-PCR結(jié)果顯示,與sham組相比,burn組大鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量顯著增加(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量明顯降低(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量又明顯上升(P<0.05,見圖2)。免疫熒光染色顯示,與sham組相比,burn組大鼠腎組織中NF-κB表達(dá)量顯著增加(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織中NF-κB表達(dá)量明顯降低(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織中NF-κB的表達(dá)又明顯增強(qiáng)(P<0.05,見圖3)。

與sham組相比,*P<0.05,**P<0.01;與burn組相比,##P<0.01;與burn+ECH組相比,&&P<0.01圖2 各組大鼠腎組織炎癥因子表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of expression of inflammatory response factors in renal tissue between groups

圖3 各組大鼠腎組織NF-κB表達(dá)水平比較 (×400)Figure 3 Comparison of expression of NF-κB in renal tissue between groups (×400)

2.3 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較

檢測(cè)大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平顯示,與sham組相比,burn組大鼠腎組織中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量顯著減低,膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著增加(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織中SOD和GSH-Px的含量顯著升高,MDA含量顯著減少(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織中SOD和GSH-Px的含量又顯著下降,MDA含量又顯著上升(P<0.05,見圖4)。Western blot顯示,與sham組相比,burn組大鼠腎組織中g(shù)p91phox生成量顯著增加(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織中g(shù)p91phox的生成明顯被抑制(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織中g(shù)p91phox的生成又明顯增多(P<0.05,見圖4)。

2.4 各組大鼠腎組織凋亡水平及SIRT3信號(hào)表達(dá)比較

Western blot顯示,與sham組相比,burn組大鼠腎組織中SIRT3蛋白表達(dá)及SIRT3去乙?；钚燥@著減低(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織中SIRT3蛋白表達(dá)及SIRT3去乙?；钚燥@著升高(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織中SIRT3蛋白表達(dá)及SIRT3去乙?；钚杂诛@著被抑制(P<0.05,見圖5)。TUNEL染色檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示,與sham組相比,burn組大鼠腎組織凋亡細(xì)胞明顯增加,凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡明顯被抑制,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);而與burn+ECH組比較,burn+ECH+3-TYP組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡又明顯增多,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05,見圖5,6)。

與sham組相比,*P<0.05,**P<0.01;與burn組相比,##P<0.01;與burn+ECH組相比,&&P<0.01圖4 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較Figure 4 Comparison of renal oxidative stress level between groups

與sham組相比,*P<0.05,**P<0.01;與burn組相比,##P<0.01;與burn+ECH組相比,&&P<0.01圖5 各組大鼠腎組織SIRT3信號(hào)及凋亡蛋白表達(dá)比較Figure 5 Comparison of expression of SIRT3 signaling and apoptosis protein in renal tissue between groups

圖6 各組大鼠腎組織凋亡水平比較 (×400)Figure 6 Comparison of apoptosis level in renal tissue between groups (×400)

3 討論

急性腎損傷是臨床常見的一組綜合征,常繼發(fā)于各種嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、外科術(shù)后應(yīng)激和腎毒性藥物等高危因素[13]。燒傷作為一種嚴(yán)重創(chuàng)傷,除導(dǎo)致皮膚和/或皮下組織直接的熱力學(xué)損傷之外,還可誘發(fā)重要臟器的繼發(fā)性損害[1]。急性腎損傷已成為大面積深度燒傷患者的主要并發(fā)癥,并且早期急性腎損傷的出現(xiàn)往往預(yù)示著重度燒傷患者的不良預(yù)后甚至死亡[3,14]。盡管與嚴(yán)重?zé)齻嚓P(guān)的急性腎損傷發(fā)病機(jī)制取得了一定的研究進(jìn)展[4,5],但對(duì)該疾病人群的治療卻沒有相應(yīng)程度的進(jìn)步。因此,尋找可能的早期干預(yù)方式對(duì)于改善重度燒傷后急性腎損傷患者的治療效果、減少社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。

近年來,關(guān)于燒傷后急性腎損傷發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制多集中于炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷與組織細(xì)胞凋亡等方面[4,5,15]。一方面,重度燒傷患者的損傷壞死物質(zhì)入血合并創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體全身炎癥反應(yīng),燒傷早期即存在各種炎癥細(xì)胞動(dòng)員,其伴隨著大量炎癥介質(zhì)的釋放可通過血液循環(huán)可到達(dá)各遠(yuǎn)位臟器(如腎臟),進(jìn)而引起血管通透性的增加以及腎組織的直接損傷[12,16]。另一方面,燒傷患者常伴有機(jī)體氧化應(yīng)激水平的升高、循環(huán)及局部組織中的活性氧釋放增加,導(dǎo)致腎臟組織細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和內(nèi)源性抗氧化酶耗損,并最終引起細(xì)胞內(nèi)蛋白氧化和DNA損傷[17,18]。而細(xì)胞凋亡是腎組織在面對(duì)燒傷、缺血、輻射、創(chuàng)傷和毒物等損傷時(shí)的常見反應(yīng),循環(huán)系統(tǒng)中促凋亡介質(zhì)的釋放參與了患者腎功能改變并影響預(yù)后[19,20]。在本研究中,我們同樣發(fā)現(xiàn),與sham組相比,burn組大鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的含量明顯升高,NF-κB表達(dá)量明顯增加;同時(shí)burn組大鼠腎組織中抗氧化物SOD和GSH-Px的含量顯著降低,脂質(zhì)過氧化物MDA含量明顯上升,氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白gp91phox的生成明顯增多;此外,burn組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡明顯,凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著上調(diào)。以上結(jié)果進(jìn)一步明確了炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞調(diào)亡是燒傷后急性腎損傷重要損傷機(jī)制,而針對(duì)上述損傷機(jī)制的早期干預(yù)可能是處理燒傷后急性腎損傷的有效途徑之一。

研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等廣泛的藥理作用,對(duì)多個(gè)系統(tǒng)的疾病展現(xiàn)了良好的治療效果[21]。值得注意的是,松果菊苷近年來被證實(shí)具有顯著的腎臟保護(hù)作用,牛世煜等[22]報(bào)道松果菊苷可能通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)發(fā)生,進(jìn)而減輕糖尿病腎損傷。姜瑞鳳等[23]報(bào)道松果菊苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷起保護(hù)作用,相關(guān)機(jī)制可能與松果菊苷抑制細(xì)胞凋亡和炎癥產(chǎn)生有關(guān)。此外,我們課題組前期研究也觀察到松果菊苷可以明顯減輕膿毒癥小鼠急性腎損傷[10]。在本研究中,我們首先發(fā)現(xiàn),與burn組相比,burn+ECH組大鼠血清中兩項(xiàng)急性腎損傷診斷的敏感生物學(xué)標(biāo)記BUN和Cr的含量均顯著降低,并且burn+ECH組大鼠腎組織病理?yè)p傷明顯減輕,腎組織損傷評(píng)分顯著降低,以上結(jié)果提示,松果菊苷對(duì)于燒傷后急性腎損傷具有潛在的緩解作用。進(jìn)一步探討其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn),與burn組相比,burn+ECH組大鼠腎組織中炎癥因子含量明顯降低,炎癥反應(yīng)明顯減弱;同時(shí)burn+ECH組大鼠腎組織中抗氧化物的含量顯著升高,脂質(zhì)過氧化物含量明顯減少,氧化應(yīng)激損傷明顯被抑制;此外,burn+ECH組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡明顯減少,凋亡率顯著下降。以上結(jié)果提示,松果菊苷可通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷與細(xì)胞凋亡發(fā)揮抵抗嚴(yán)重?zé)齻碌募毙阅I損傷作用。

沉默信息調(diào)控因子3(silent information regulator 3, SIRT3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；?主要定位于線粒體[24]。腎臟組織的管狀細(xì)胞中富含線粒體,腎小管內(nèi)線粒體的改變是腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志[25],而SIRT3作為線粒體酶參與線粒體的多種生物調(diào)節(jié),近年來被大量文獻(xiàn)證實(shí)其與急性腎損傷及急性腎損傷后修復(fù)密切相關(guān)[26]。既往研究表明,以SIRT3分子為靶點(diǎn),上調(diào)SIRT3的表達(dá)在膿毒癥、缺血再灌注、抗癌藥物及造影劑等原因?qū)е碌募毙阅I損傷中均表現(xiàn)出了積極的保護(hù)效應(yīng)[27-30]。特別值得注意的是,我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),松果菊苷可明顯緩解膿毒癥導(dǎo)致的急性腎損傷,其機(jī)制可能與激活SIRT3信號(hào)有關(guān)[10]。然而SIRT3能否介導(dǎo)松果菊苷減輕嚴(yán)重?zé)齻蠹毙阅I損傷仍有待于進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),與sham組相比,burn組大鼠腎組織中SIRT3蛋白表達(dá)及去乙?；钚跃@著減低,給予松果菊苷處理后,burn+ECH組大鼠腎組織中SIRT3蛋白及去乙酰化活性表達(dá)均顯著升高,而給予SIRT3特異性抑制劑3-TYP不僅可以逆轉(zhuǎn)松果菊苷對(duì)SIRT3信號(hào)的激活作用,也顯著抵消了松果菊苷在嚴(yán)重?zé)齻碌募毙阅I損傷中的抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷與抗凋亡作用。以上結(jié)果提示,激活SIRT3信號(hào)通路是松果菊苷減輕嚴(yán)重?zé)齻蠹毙阅I損傷的潛在分子機(jī)制之一。

綜上所述,松果菊苷通過抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)減輕嚴(yán)重?zé)齻笫蠹毙阅I損傷,其分子機(jī)制與激活SIRT3信號(hào)通路相關(guān)。我們的研究為臨床上應(yīng)用松果菊苷保護(hù)嚴(yán)重?zé)齻颊叩哪I臟功能提供了新的理論依據(jù)。