益腦心顆粒制備中7個(gè)活性成分轉(zhuǎn)移率的研究

王 鑫,黃美玲,蘇玉霞,任曉東,劉 濤,陳明會(huì)*

(1漢中市人民醫(yī)院藥劑科,漢中 723000;2漢中市鐵路中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部;*通訊作者,E-mail:951036067@qq.com)

益腦心顆粒(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025079),具有活血散瘀,平肝熄風(fēng)等功效,由六味中藥即天麻、山楂、郁金、丹參、制何首烏、川芎組成[1-3]。方中川芎含有腺苷、沒(méi)食子酸、阿魏酸等成分,其對(duì)心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)有治療作用[4-6];天麻含有沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、天麻素、腺苷等成分,具有鎮(zhèn)靜催眠與腦保護(hù)等作用[7-9];何首烏含有沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷類、腺苷等成分,具有明顯的神經(jīng)保護(hù)與抗衰老等作用[10-12];郁金有抗炎、腫瘤等作用[13];山楂有較高含量的沒(méi)食子酸,有抗氧化作用[14-19];丹參中含丹酚酸B、迷迭香酸、5-羥甲基糠醛等成分,有改善微循環(huán)、抗凝血等作用[20,21]。前期筆者對(duì)益腦心顆粒進(jìn)行了定性研究,并鑒定出制劑中的丹酚酸B、迷迭香酸、二苯乙烯苷、5-羥甲基糠醛、沒(méi)食子酸、天麻素、腺苷等成分[22]。本文旨在通過(guò)建立HPLC法測(cè)定益腦心顆粒與藥材中的7個(gè)活性成分的含量,探討7種成分在制備過(guò)程中的轉(zhuǎn)移情況,為制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津Prominence UFLC型高效液相色譜儀,配SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器與LC/Labsoluion色譜工作站,日本島津公司;KQ-100DA臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;十萬(wàn)分之一電子分析天平,型號(hào)MD200,德國(guó)賽多利斯公司;0.45 μm微孔濾膜,東莞市皇賢科學(xué)儀器有限公司。乙腈、甲醇,色譜級(jí),美國(guó)Fisher公司;水為娃哈哈純凈水,公司名稱杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;磷酸、無(wú)水乙醇均為分析純,北科化學(xué)天津有限責(zé)任公司。腺苷(批號(hào)10879-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)、天麻素(批號(hào)110807-202010,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.5%)、沒(méi)食子酸(批號(hào)110831-201906,質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.5%)、5-羥甲基糠醛(批號(hào)111626-202013,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%)、迷迭香酸(批號(hào)111871-202007,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%)等對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;二苯乙烯苷(批號(hào)HO118401,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、丹酚酸B(批號(hào)HS034208,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%),購(gòu)于寶雞辰光生物技術(shù)有限公司;藥材與益腦心顆粒(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025079,規(guī)格7 g×9袋/盒),購(gòu)自陜西漢王藥業(yè)股份有限公司,藥材與制劑對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 藥材與制劑對(duì)應(yīng)關(guān)系

1.2 含量測(cè)定方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),按表2進(jìn)行梯度洗脫。記錄時(shí)間:70 min。體積流量:0.8 ml/min;柱溫:28 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;進(jìn)樣量:10 μl[22]。

表2 梯度洗脫程序方法

1.2.2 各種溶液的制備

1.2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取沒(méi)食子酸5.46 mg,5-羥甲基糠醛8.04 mg于100 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,作為A溶液;再分別精密稱取腺苷18.05 mg,天麻素5.86 mg,二苯乙烯苷3.06 mg,迷迭香酸4.08 mg,丹酚酸B 20.41 mg置于10 ml量瓶中,加A溶液至刻度,搖勻,即得7種混合對(duì)照溶液,作為儲(chǔ)備液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5袋內(nèi)容物,研細(xì),混勻,取7 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇25 ml,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%乙醇補(bǔ)足其減失的質(zhì)量,搖勻,0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液得到供試品溶液[22]。

1.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按益腦心顆粒處方分別制備缺天麻樣品(天麻素陰性對(duì)照),缺制首烏樣品(二苯乙烯苷陰性對(duì)照),缺丹參樣品(迷迭香酸與丹酚酸B陰性對(duì)照),缺天麻、山楂、川芎與制首烏樣品(沒(méi)食子酸陰性對(duì)照與腺苷陰性對(duì)照),缺天麻與丹參(5-羥甲基糠醛陰性對(duì)照)的陰性樣品;再按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備各陰性樣品溶液。

1.2.2.4 天麻藥材溶液的制備 取本品粉末0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇25 ml,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%乙醇補(bǔ)足其減失的質(zhì)量,搖勻,0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液得到供試品溶液。

1.2.2.5 制首烏藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項(xiàng)。

1.2.2.6 丹參藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項(xiàng)。

1.2.2.7 川芎藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項(xiàng)。

1.2.2.8 山楂藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項(xiàng)。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取儲(chǔ)備液0.010,0.050,0.250,0.500,1.000 ml置于各個(gè)2 ml量瓶中,分別加50%甲醇定容,混勻,即得系列混合對(duì)照溶液。用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),進(jìn)樣。以各對(duì)照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(x),峰面積值為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸。

1.2.3.2 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取混合對(duì)照溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl進(jìn)樣,分別記錄色譜圖。

1.2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)010012),重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)得腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積的RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)010012),在第0,2,4,8,12,24小時(shí)進(jìn)樣。測(cè)定腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積的RSD值。

1.2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品(批號(hào)010012)6份,分別按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品,按“1.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。測(cè)定平均含量與RSD值。

1.2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(批號(hào)010012)內(nèi)容物,添加對(duì)照品后,照“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,制備6份樣品溶液,測(cè)定峰面積計(jì)算加樣回收率。

1.2.3.7 藥材含量測(cè)定 分別精密稱取川芎、制何首烏、丹參、郁金、山楂、天麻樣品0.5 g,分別按“1.2.2.4-1.2.2.8”項(xiàng)下方法制備藥材供試品,按“1.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。

1.2.3.8 制劑含量測(cè)定 精密稱取9批樣品,分別按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品,按“1.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。測(cè)定腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量(mg/g)。

1.2.4 轉(zhuǎn)移率 依據(jù)如下公式計(jì)算:藥材中成分轉(zhuǎn)移率(%)=對(duì)應(yīng)制劑中成分總含量(mg)/處方藥材成分總含量(mg)×100%。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

結(jié)果表明7種對(duì)照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見(jiàn)表3)。

表3 對(duì)照品的線性方程、線性濃度范圍及相關(guān)系數(shù)

2.2 專屬性試驗(yàn)

結(jié)果表明陰性對(duì)照無(wú)干擾,專屬性強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。

1.腺苷;2.天麻素;3.沒(méi)食子酸;4.5-羥甲基糠醛;5.二苯乙烯苷;6.迷迭香酸;7.丹酚酸B圖1 混合對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatogram of mixed control samples, test samples and negative control samples

2.3 精密度試驗(yàn)

結(jié)果顯示,腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.95%,0.93%,0.89%,1.02%,0.94%,0.91%,0.87%,均小于2.0%(見(jiàn)表4),表明該方法精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果顯示,腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.82%,0.96%,1.13%,1.01%,1.21%,1.15%,1.08%,均小于2.0%(見(jiàn)表5),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果顯示,腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積,計(jì)算得平均含量的RSD均小于2.5%(見(jiàn)表6),表明該方法重復(fù)性良好。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

結(jié)果顯示,腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積,分別計(jì)算得各成分平均回收率在97%-99%之間,各成分RSD均小于2.0%(見(jiàn)表7),表明該方法回收率良好。

表7 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 藥材含量測(cè)定

藥材含量測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表8。天麻中腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥基糠醛的平均含量分別為10.732 5 mg/g,11.107 4 mg/g,2.660 5 mg/g,27.233 2 mg/g;制首烏中腺苷、沒(méi)食子酸、二苯乙烯苷的平均含量分別為2.247 4 mg/g,16.136 8 mg/g,7.074 4 mg/g;丹參中5-羥基糠醛、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量分別為109.446 8 mg/g,2.042 0 mg/g,31.988 4 mg/g;川芎中腺苷、沒(méi)食子酸的平均含量分別為482.166 8 mg/g,10.592 0 mg/g;山楂中沒(méi)食子酸的平均含量為22.197 4 mg/g。

表8 三批藥材7個(gè)成分測(cè)定結(jié)果

2.8 制劑含量測(cè)定

制劑含量測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表9。010012,010013,010014,010017,010018,010019,010021,010022,010023批中腺苷、天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量分別為0.477 41 mg/g,0.680 90 mg/g,0.051 40 mg/g,0.130 06 mg/g,1.146 14 mg/g,0.342 45 mg/g,4.753 30 mg/g。

表9 批益腦心顆粒中7個(gè)成分含量試驗(yàn)結(jié)果 (mg/g)

2.9 轉(zhuǎn)移率

7個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率均超過(guò)50%,RSD均小于3%,最小轉(zhuǎn)移率成分為二苯乙烯苷,最大轉(zhuǎn)移率成分為天麻素(見(jiàn)表10)。

表10 三批藥材對(duì)應(yīng)9批制劑轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件

使用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)益腦心顆粒樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果表明腺苷的最大吸收波長(zhǎng)為265 nm,天麻素為220 nm和269 nm,沒(méi)食子酸為271 nm,5-羥甲基糠醛為281 nm,二苯乙烯苷為309 nm,迷迭香酸為311 nm,丹酚酸B為288nm,因此依據(jù)每個(gè)化合物的最大吸收值,確定共同檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。色譜條件的選擇與供試品制備方法依據(jù)文獻(xiàn)[22]。

3.2 專屬性實(shí)驗(yàn)研究

腺苷在川芎、天麻、制首烏中均含有,所以陰性對(duì)照制備供試品是需要去除;沒(méi)食子酸在天麻、山楂、川芎、制首烏含有,制備陰性對(duì)照時(shí)需要去掉天麻、山楂、川芎、制首烏;5-羥甲基糠醛在天麻、丹參中均含有,制備陰性對(duì)照時(shí)需要去掉天麻、丹參;二苯乙烯苷僅在制首烏中含有,制備陰性對(duì)照時(shí)需要去掉制首烏;迷迭香酸、丹酚酸B僅在丹參中含有,制備陰性對(duì)照時(shí)需要去掉丹參;天麻素僅在天麻中含有,制備陰性對(duì)照時(shí)需要去掉天麻。

3.3 轉(zhuǎn)移率研究

對(duì)3批藥材對(duì)應(yīng)9批益腦心顆粒中7種成分含量分析,結(jié)果,平均轉(zhuǎn)移率大小順序:天麻素>迷迭香酸>沒(méi)食子酸>腺苷>5-羥甲基糠醛>丹酚酸B>二苯乙烯苷。二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率較低可能是在生產(chǎn)過(guò)程中受光照、溫度及空氣中氧化等原因影響[23,24],但轉(zhuǎn)移率均在50%以上,表明藥材中7種活性成分的轉(zhuǎn)移率較高,說(shuō)明制劑工藝良好,很好地控制了制劑質(zhì)量。

綜上所述,成功建立益腦心顆粒7種成分的HPLC含量測(cè)定方法,該方法操作簡(jiǎn)單易于實(shí)施、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng),因此該方法可作為益腦心顆粒質(zhì)量的有效評(píng)價(jià)方法之一;7種成分的轉(zhuǎn)移率較高,表明制劑的制備工藝有利于7個(gè)活性成分的轉(zhuǎn)移,為制劑生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù),為制劑療效提供了理論基礎(chǔ)。