多巴胺1類受體活化減輕心力衰竭早期炎癥反應的實驗研究

武栗妃,馬友才,王 霞,闞曉玉

(1山西醫(yī)科大學病理生理教研室,太原 030001;2首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院急診科;3首都醫(yī)科大學病理生理教研室;4首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院血液科;*通訊作者,E-mail:wifi04151127@163.com)

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段,發(fā)病率和病死率極高。炎癥反應在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[1-3]。炎癥因子的水平與心力衰竭的不良預后具有明顯的相關(guān)性[1-4]。多巴胺及多巴胺受體除了在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用,在心血管系統(tǒng)中也具有重要的作用,臨床上多巴胺多用于急性心力衰竭的治療[5]。多巴胺通常作用于多巴胺受體(DR)發(fā)揮作用,包括D1和D2類受體。D1類受體由D1R和D5R組成,活化后可激活腺苷酸環(huán)化酶的活性;D2類受體由D2R、D3R和D4R,活化后抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性[6,7]。以往研究發(fā)現(xiàn)多巴胺通過作用于多巴胺1類受體抑制系統(tǒng)性炎癥反應在膿毒癥中發(fā)揮保護作用[8]。此外,多巴胺1類受體可以調(diào)節(jié)免疫細胞的功能在自身免疫性疾病中具有重要作用[9]。然而多巴胺1類受體是否調(diào)控炎癥反應進而參與心力衰竭的發(fā)病過程目前尚不清楚。本研究通過橫向主動脈弓縮窄術(shù)(transverse aortic constriction,TAC)建立心力衰竭的模型,觀察給予多巴胺1類受體的激動劑非諾多泮對心力衰竭早期炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 為了觀察多巴胺受體在心力衰竭小鼠心臟中表達的變化,健康雄性清潔級C57BL/6J小鼠20只,8周齡,體質(zhì)量20-22 g,購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司。隨機分為兩組:①假手術(shù)組:開胸不做橫向主動脈弓縮窄術(shù),喂養(yǎng)6周;②TAC組:TAC術(shù)后喂養(yǎng)6周。為觀察多巴胺受體5激動劑非諾多泮對TAC早期心臟炎癥反應的影響,健康雄性C57BL/6J小鼠40只,按隨機數(shù)字表隨機分為以下4組:①假手術(shù)聯(lián)合磷酸鹽緩沖溶液(PBS)組:開胸不做橫向主動脈弓縮窄術(shù),手術(shù)后立即腹腔注射PBS,按10 mg/kg,每天1次,連續(xù)注射1周;②假手術(shù)聯(lián)合非諾多泮組:手術(shù)后立即腹腔注射非諾多泮,按10 mg/kg,每天1次,連續(xù)注射1周;③TAC聯(lián)合PBS組:TAC術(shù)后立即腹腔注射PBS,按10 mg/kg,每天1次,連續(xù)注射1周;④TAC聯(lián)合非諾多泮組:手術(shù)后立即腹腔注射非諾多泮,按10 mg/kg,每天1次,連續(xù)注射1周。每組10只小鼠,以上分組均為普通飲食,自由飲水飲食。

1.1.2 主要儀器與試劑 NIS-ELEMENTS定量分析軟件,ECLIPSE 90i顯微鏡(Nikon,日本),蠟塊包埋機(Leica,德國),Vivid 7小動物超聲心動儀(GE Healthcare,英國),NanoDrop spectrophotometer(Thermo Scientific,美國)。非諾多泮(Sigma,美國),D5R抗體(Santa Cruz biotechnology公司,美國),3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自中杉抗體公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Agilent Technologies,美國),SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 TAC模型的制備 采用橫向主動脈弓縮窄術(shù)(transverse aortic constriction,TAC)的方法,設(shè)立假手術(shù)組。具體方法為:將小鼠用1%戊巴比妥鈉將小鼠麻醉,使其仰臥位固定于手術(shù)臺,在顯微鏡下,從頸部正中線處切開皮膚暴露胸腔部位,從胸骨左上第二肋間進入胸腔,將胸腺移開視野暴露主動脈弓,在分離的頭臂干和左頸總動脈之間的橫向動脈弓平行的部位,將其用7-0絲線和27號針頭緊緊地綁在一起,然后立即去掉針頭,這樣就縮窄成直徑為0.4 mm的動脈[10]。手術(shù)后7 d,測定主動脈弓血流峰值情況,大于2 000 mm/s表明手術(shù)成功,待TAC術(shù)后1周測定心功能,之后于麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠。

1.2.2 心功能測定 TAC術(shù)后1周測量小鼠心臟功能;小鼠用3%異氟烷(isofluorane)麻醉直到心率穩(wěn)定在每分鐘400-500次。使用40 MHz探頭高解析度微型超聲波系統(tǒng)測量得到收縮期、舒張期以及左室前后壁的二維短軸圖像。射血分數(shù)(EF)和短軸縮短率(FS)分別計算使用Vevo分析軟件(版本2.2.3)。所有測試對象均采用相同技術(shù)參數(shù),并至少測量5個連續(xù)周期,取其平均數(shù)[10,11]。

1.2.3 組織病理切片及HE(蘇木精-伊紅染液)染色 用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟后剪下整個心臟浸泡于福爾馬林固定24 h,制作石蠟切片。蘇木素伊紅染色程序及結(jié)果判定參見試劑盒說明書(Solarbio公司)。采用尼康電子顯微鏡(N90i)采集圖像[12]。

1.2.4 組織病理切片及免疫組織化學染色 用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟后剪下整個心臟浸泡于福爾馬林固定24 h,制作石蠟切片。采用免疫組織化學法染色觀察心臟組織炎癥細胞浸潤。免疫組織化學法的染色程序及結(jié)果判定參見試劑盒說明書(邁新公司)。采用尼康電子顯微鏡(N90i)采集圖像[12]。

1.2.5 real-time PCR法 檢測TAC術(shù)后6周心臟多巴胺受體1-5 mRNA水平及TAC術(shù)后1周心臟炎癥相關(guān)因子的mRNA表達。每組各取5只TAC術(shù)后小鼠,收取整個心臟組織,Trizol法抽提總RNA。測定RNA純度、濃度,后反轉(zhuǎn)為cDNA,進行real-time PCR[13]。反應條件為:反應溫度95 ℃ 5 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 45 s(45循環(huán));熔解曲線:55 ℃→95 ℃(升高0.5 ℃/cycle,81循環(huán))。使用軟件自行設(shè)計引物,由上海生工公司合成(見表1)。

表1 基因名稱和引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 多巴胺受體在TAC術(shù)后6周心臟中的表達

實時熒光定量PCR可見,與假手術(shù)組比較,TAC組心臟多巴胺受體1、多巴胺受體3及多巴胺受體4在心臟的表達沒有變化;多巴胺受體2水平降低,多巴胺受體5的水平升高(見圖1A)。免疫組化結(jié)果可見,與假手術(shù)組比較,TAC組多巴胺受體5在心臟的表達水平明顯升高(見圖1B)。

圖1 多巴胺受體在TAC術(shù)后6周心臟中的表達Figure 1 The expression of dopamine receptor in heart at week 6 after TAC

2.2 橫向主動脈弓成功指標評價

橫向主動脈縮窄術(shù)后1周,多普勒超聲模式下,結(jié)扎處可見彩色血流信號,血流速度增加,血流速度峰值可達2 000 mm/s以上(見圖2)。假手術(shù)組小鼠主動脈弓左頸總動脈與頭臂干之間血流速度為800 mm/s(見圖2)。

圖2 橫向主動脈術(shù)弓縮窄術(shù)后1周的超聲影像圖Figure 2 Ultrasound image at week 1 after TAC

2.3 四組術(shù)后1周心臟炎癥細胞浸潤及炎癥因子水平

與假手術(shù)+PBS組比較,TAC+PBS組術(shù)后1周心臟浸潤的炎癥細胞明顯增多;與TAC+PBS組比較,TAC+非諾多泮組心臟炎癥細胞的浸潤減少(見圖3A)。與假手術(shù)+PBS組比較,TAC+PBS組術(shù)后1周心臟炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯升高(4.18±0.31vs10.14±0.99,P<0.05;3.79±0.08vs14.43±2.35,P<0.05);與TAC+PBS組比較,TAC+非諾多泮組心臟炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯降低(10.14±0.99vs4.19±0.47,P<0.05;14.43±2.35vs4.36±0.72,P<0.05,見圖3B)。

2.4 四組術(shù)后1周的心功能比較

與假手術(shù)+PBS組比較,TAC+PBS組術(shù)后1周心臟射血分數(shù)與短軸縮短分數(shù)無明顯變化(P>0.05);與TAC+PBS組比較,TAC+非諾多泮組術(shù)后1周心臟射血分數(shù)和短軸縮短分數(shù)無明顯的變化(P>0.05,見圖4,表2)。

與假手術(shù)+PBS組比較,#P<0.05;與TAC+PBS組比較,*P<0.05B.實時熒光定量PCR檢測橫向主動脈弓縮窄術(shù)后1周心臟炎癥因子的水平圖3 四組小鼠術(shù)后1周心臟炎癥細胞浸潤及炎癥因子水平Figure 3 Infiltration of inflammtory cells and mRNA levels of inflammatory factors in heart at week 1 after operation in four groups

表2 四組小鼠術(shù)后1周射血分數(shù)與短軸縮短分數(shù)比較 (%)

3 討論

各種心臟疾病發(fā)展到晚期均會出現(xiàn)心力衰竭,持續(xù)的炎癥反應促進心力衰竭的發(fā)展進程。炎癥細胞及炎癥介質(zhì)介導的炎癥反應導致心肌肥大、心肌細胞凋亡,心肌纖維化最終發(fā)生病理性心肌重塑[14]。炎癥介質(zhì)水平增高與心力衰竭不良預后有關(guān)。神經(jīng)系統(tǒng)通過釋放神經(jīng)激素或神經(jīng)遞質(zhì)影響免疫功能[1]。目前越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)在炎癥反應中具有重要的調(diào)節(jié)作用[15]。多巴胺及其受體除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的作用,在損傷或感染所致的系統(tǒng)性炎癥反應及心血管疾病中也具有重要的作用。多巴胺或受體的激動劑作用于多巴胺受體能夠調(diào)節(jié)免疫細胞的活化、增殖和細胞因子的產(chǎn)生。腎臟多巴胺受體具有調(diào)節(jié)血壓的作用[12,16]。有研究表明心臟特異性過表達腺苷酸環(huán)化酶可以改善心肌病小鼠的心功能。腺苷酸環(huán)化酶用于心力衰竭的治療目前在進行臨床試驗[17,18]。抑制磷酸二酯酶2而增加cAMP的水平可以阻止心肌肥厚[19]。此外,cAMP活化的PKA使其底物組蛋白脫乙酰酶磷酸化具有心肌細胞肥大的作用[20,21]。因此本實驗提出假設(shè):作為cAMP-PKA的上游,多巴胺1類受體(多巴胺受體1和多巴胺受體5)活化可以減輕心力衰竭早期的炎癥反應。

在本實驗中,使用實時熒光定量PCR檢測心力衰竭小鼠心臟組織中多巴胺受體的mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比,多巴胺受體1、多巴胺受體3與多巴胺受體4的水平?jīng)]有改變,多巴胺受體2的mRNA水平降低,多巴胺受體2在心力衰竭中的作用以往有文獻報道。多巴胺受體5水平明顯升高。為了進一步驗證多巴胺受體5在心力衰竭中的改變,我們通過免疫組化方法觀察心力衰竭小鼠心臟多巴胺受體5的表達,與對照組相比,該受體的表達明顯增多,提示多巴胺受體5參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。為了研究多巴胺受體5在心力衰竭早期炎癥反應中的作用,我們采用橫向主動脈弓縮窄術(shù)后1周的小鼠,心臟多普勒超聲檢查橫向主動脈弓縮窄術(shù)后1周血流峰值,結(jié)果可以看到橫向主動脈縮窄術(shù)后血流峰值可達2 000 mm/s,而假手術(shù)組血流峰值為800 mm/s,提示橫向主動脈弓縮窄術(shù)成功。橫向主動脈弓縮窄術(shù)小鼠腹腔連續(xù)注射非諾多泮1周觀察其對炎癥反應的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,非諾多泮明顯減少心臟炎癥細胞的數(shù)量及炎癥介質(zhì)的水平。提示多巴胺受體具有抑制心力衰竭早期心臟的炎癥反應。我們同時觀察非諾多泮對心力衰竭早期心功能的影響,與對照組相比,反應心功能的射血分數(shù)與短軸縮短分數(shù)沒有明顯的變化。以上結(jié)果提示多巴胺受體5在心力衰竭的早期主要介導心臟的炎癥反應。

本研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體5活化后可以抑制心力衰竭早期炎癥反應,多巴胺受體5對心力衰竭晚期心肌肥厚及心肌纖維化是否有影響,我們將在多巴胺受體5轉(zhuǎn)基因小鼠中進行深入研究,本研究首次發(fā)現(xiàn)了多巴胺受體5在心血管疾病中的新作用,可能為心力衰竭的臨床治療提供一定的理論和實踐依據(jù)。