KDM6A基因?qū)毙运柘蛋籽〖?xì)胞增殖、凋亡的影響

駱婷婷,劉 洋,張 瑞,于文燕

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心實驗室,烏魯木齊 830054;2新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:945265580@qq.com)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其特征主要是血液和骨髓中髓系原始細(xì)胞的異?？寺U(kuò)增[1],在我國常見于成人,且發(fā)病率隨著年齡的增長呈上升趨勢[2,3]?，F(xiàn)已研究確定該病主要生物學(xué)特征是細(xì)胞增殖失控,治療手段也主要針對這一生物學(xué)特征進(jìn)行,但是,還是存在一部分患者停藥復(fù)發(fā)等問題[4]。隨著對白血病發(fā)病分子機(jī)制深入研究,靶向治療成為白血病治療的發(fā)展趨勢[5]。賴氨酸特異性去甲基化酶6A(lysine-specific demethylase 6A,KDM6A)主要是組蛋白H3的第27位賴氨酸(histone H3 at lysine 27,H3K27)去甲基化酶,可以催化H3K27三甲基化(H3K27 tri-methylated，H3K27me3)去甲基化，促進(jìn)基因表達(dá),在胚胎發(fā)育過程中起到重要的作用[6,7]。已有研究報道,KDM6A突變和缺失參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括食管癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤[8-11]等。但KDM6A在急性髓系白血病中作用尚不清楚。本實驗分別通過過表達(dá)和敲減KDM6A基因,來觀察對急性髓系白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937購自美國ATCC(貨號:DA-C5751)。BCA蛋白檢測試劑盒(貨號:23250)、MTT檢測試劑盒(貨號:4890-025-K)購自上海嶸崴達(dá)實業(yè)有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號:556547)及流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(貨號:11668027)購自美國Invitrogen;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit(Perfect Real Time)(貨號:RR047AA)、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(貨號:RR820A)購自日本TAKARA公司;GAPDH兔多抗購自美國Bioworld公司;兔抗人KDM6A(貨號:ab36938)、兔抗人H3K27me3(ab192985)、兔抗人Caspase-3(貨號:ab13748)購自美國Abcam;兔抗人c-Myc(貨號:MAB3696)、兔抗人Cyclin D1(貨號:MAB4314)、兔抗人Bcl-2(貨號:MAB8272)、兔抗人Bax(貨號:MAB846)購于美國R&DSYSTEMS;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號:sc2004)購自美國Santa Cruz公司。

二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國SHEL-LAB公司;酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀購自芬蘭雷勃Multiskan MK-3;倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 取出凍存管,進(jìn)行U937細(xì)胞復(fù)蘇,快速加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基中,細(xì)胞貼壁后,從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞瓶進(jìn)行換液,向培養(yǎng)瓶中加入適量的10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)。一般隔兩天換液1次,待細(xì)胞長滿瓶壁85%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代。將細(xì)胞按實驗分5組:U937細(xì)胞組、sh-control組、sh-KDM6A組、pcDNA3.0組、pcDNA3.0-KDM6A組,其中sh-control組、sh-KDM6A組、pcDNA3.0組、pc-DNA3.0-KDM6A組細(xì)胞使用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染慢病毒空載體、shKDM6A慢病毒載體、pcDNA3.0、pcDNA3.0-KDM6A過表達(dá)載體。

1.2.2 shKDM6A慢病毒載體包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)U937細(xì)胞系建立 以1.6×106/瓶的密度接種U937細(xì)胞于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶;培養(yǎng)至細(xì)胞融合度40%左右,進(jìn)行轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000 ∶質(zhì)粒=2 ∶1;輕輕混勻,室溫靜置15 min;室溫靜置結(jié)束后滴加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37 ℃,5%CO2培養(yǎng);6-8 h后更換為10%FBS RPMI-1640完全培養(yǎng);48 h后收取上清中的慢病毒;以2×105個細(xì)胞/孔的密度接種U937細(xì)胞于6孔板;培養(yǎng)至細(xì)胞融合度30%-40%,棄去1 ml培養(yǎng)基,加入1 ml慢病毒感染細(xì)胞;48 h用含10 μg/ml嘌呤霉素10%FBS RPMI-1640完全培養(yǎng)基持續(xù)篩選;繼續(xù)使用含2 μg/ml嘌呤霉素RPMI-1640完全培養(yǎng)基篩選維持,待感染效果鑒定。

1.2.3 pcDNA3.0-KDM6A過表達(dá)載體構(gòu)建 從NCBI獲取KDM6A基因cDNA序列(NM-001291415.2),設(shè)計引物送上海生工生物有限公司進(jìn)行合成,以U937細(xì)胞cDNA為模板PCR擴(kuò)增,切膠回收目的片段,經(jīng)AgeⅠ和XhoⅠ雙酶切后,插入pcDNA3.0真核表達(dá)載體,經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定,構(gòu)建pcDNA3.0-KDM6A真核表達(dá)載體,用于后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖 根據(jù)實驗需求進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),以1×105cell/ml接種于96孔板中,每孔100 μl,在培養(yǎng)48 h后,加入10 μl的MTT溶液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入150 μl DMSO震蕩混勻,用酶標(biāo)儀檢測492 nm的OD值。細(xì)胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。重復(fù)上述實驗3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒用于檢測細(xì)胞凋亡。培養(yǎng)24 h后,按照試劑盒的說明書,分別在細(xì)胞中先添加FITC-AnnexinⅤ 5 μl再添加PI 5 μl,然后進(jìn)行20 min室溫避光反應(yīng),并采用流式細(xì)胞術(shù)觀察計算。

1.2.6 qRT-PCR檢測KDM6A、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平 Trizol法進(jìn)行RNA提取:靜置5 min使細(xì)胞完全裂解;每1 ml Trizol試劑加入200 μl氯仿;反轉(zhuǎn)錄所得cDNA存放-20 ℃。并通過SYBR Green試劑盒檢測KDM6A、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平。循環(huán)條件如下:95 ℃ 10 min,然后是94 ℃ 10 s,58 ℃ 25 s和72 ℃ 30 s,32個循環(huán),然后72 ℃ 10 min。熒光定量引物見表1。

表1 實驗所用qRT-PCR引物

1.2.7 Western blot檢測KDM6A、H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 按照實驗分組處理細(xì)胞后48 h,收取細(xì)胞總蛋白。使用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞至EP管中,高速離心,收集沉淀,加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解,BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度,99 ℃蛋白變性,10%SDS凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入兔抗KDM6A(1 ∶500)、H3K27me3(1 ∶1 000)、c-Myc(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶200)、Bcl-2(1 ∶500)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶500),4 ℃冰箱孵育過夜,TBST洗滌后加入山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)孵育1 h,ECL底物顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測KDM6A轉(zhuǎn)染效率

與U937細(xì)胞組相比,sh-control組、pcDNA3.0組中KDM6A mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與sh-control組相比,sh-KDM6A組中KDM6A mRNA表達(dá)水平顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-KDM6A組中KDM6A mRNA表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 不同處理組U937細(xì)胞中KDM6A mRNA的表達(dá)

2.2 敲減和過表達(dá)KDM6A對細(xì)胞存活率影響

與U937細(xì)胞組相比,sh-control組、pcDNA3.0組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與sh-control組相比,sh-KDM6A組細(xì)胞存活率明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-KDM6A組細(xì)胞存活率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 不同處理組對U937細(xì)胞增殖影響

2.3 敲減和過表達(dá)KDM6A對細(xì)胞凋亡影響

與U937細(xì)胞組相比,sh-control組、pcDNA3.0組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與sh-control組相比,sh-KDM6A組細(xì)胞凋亡率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-KDM6A組細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表4、圖1)。

表4 不同處理組對U937細(xì)胞凋亡影響

圖1 不同處理對U937細(xì)胞凋亡的影響Figure 1 U937 cell apoptosis in different treatment groups

2.4 敲減和過表達(dá)KDM6A對細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與U937細(xì)胞組相比,sh-control組、pcDNA3.0組H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與sh-control組相比,sh-KDM6A組細(xì)胞Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-KDM6A組細(xì)胞Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,見表5、圖2)。

表5 不同處理組對細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

AML是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重危害著人類健康。在過去的50年,AML相關(guān)研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。傳統(tǒng)的白血病治療,藥效已經(jīng)達(dá)到極限,療效很難再有提高。因此,尋找新的與AML發(fā)生密切相關(guān)的基因,篩選新靶點對于AML的治療有著重要的意義。

KDM6A,又名UTX,定位于人的Xp11.3-p11.23染色體區(qū)域[12],包含1個JmiC功能域和6個四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(TPR),JmiC結(jié)構(gòu)域與組蛋白去甲基化有關(guān)。組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)中重要的調(diào)控機(jī)制之一,在基因的激活和抑制中發(fā)揮重要的作用,決定細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程。KDM6A主要通過對組蛋白3賴氨酸27(H3K27)去甲基化或乙酰化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,已被證明參與多種腫瘤的發(fā)展。有研究報道,H3K27去甲基化酶KDM6A與KMT2B協(xié)同作用,通過調(diào)節(jié)H3K4me3在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中發(fā)揮致癌作用[13]。在人類浸潤性乳腺癌中,KDM6A被認(rèn)為是介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要因素[14,15]。KDM6A在肺癌細(xì)胞中對表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表觀遺傳調(diào)控[16]。以上研究結(jié)果表明,KDM6A在腫瘤中起到致癌的作用,但是也有研究表明,KDM6A在腫瘤研究過程中起到抑癌的作用,KDM6A的缺失是膀胱癌表型的驅(qū)動因素,KDM6A沉默促進(jìn)了癌細(xì)胞生長和遷移[17]。在急性T淋巴細(xì)胞白血病的小鼠模型中,KDM6A通過調(diào)節(jié)許多具有腫瘤抑制功能的基因進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn),沉默KDM6A使患者的生存時間縮短。在大腸癌中,KDM6A通過正向調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲[20]。根據(jù)胰腺癌基因組的公共數(shù)據(jù)庫分析,大約10.7%-21.6%的胰腺癌患者樣本中,KDM6A基因發(fā)生了突變[21]。KDM6A突變也存在于其他癌癥中,包括前列腺癌[22]、髓母細(xì)胞瘤[23]。在本研究中,KDM6A作為組蛋白去甲基化酶,控制著基因表達(dá)的激活和抑制,我們通過敲減KDM6A的細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn),KDM6A敲低后細(xì)胞存活率、H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低,其蛋白表達(dá)與對照組之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義,H3K27me3被認(rèn)為是KDM6A主要發(fā)揮去甲基化作用的對象,c-Myc和Cyclin D1蛋白被普遍認(rèn)為與細(xì)胞的增殖相關(guān),Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白被普遍認(rèn)為與細(xì)胞的凋亡相關(guān),這說明KDM6A可能發(fā)揮去甲基化作用降低H3K27me3水平,在AML的增殖、凋亡過程中起到重要的作用。我們通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-KDM6A過表達(dá)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),細(xì)胞存活率、H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,而細(xì)胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。這與我們的敲減結(jié)果完全相反。說明KDM6A在急性髓系白血病細(xì)胞中扮演著重要的角色。KDM6A在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用,我們考慮可能是因為KDM6A在細(xì)胞內(nèi)通過激活不同的抑癌基因或促癌基因從而導(dǎo)致了相反的結(jié)果,后續(xù)還需要對其分子機(jī)制進(jìn)行相應(yīng)研究。

1.U937細(xì)胞組;2.sh-control組;3.sh-KDM6A組;4.pcDNA3.0組;5.pcDNA3.0-KDM6A組圖2 不同處理組對細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure 2 Expression of cell proliferation-and apoptosis-associated proteins in different treatment groups by Western blot

本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)KDM6A可抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;敲減KDM6A能夠促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。但是本研究只說明了KDM6A在AML的增殖及凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用,其具體的分子機(jī)制及其對患者預(yù)后效果的影響還需進(jìn)行進(jìn)一步的探究。