合并肝細(xì)胞性肝癌的細(xì)粒棘球蚴感染裸鼠移植瘤中NK細(xì)胞的表達(dá)

艾麥提·牙森,熱則耶·熱合曼,下依馬旦·節(jié)里力,王 恒,朱馬圖迪·朱馬洪,阿力木江·吐拉麥提,王茂林,冉 博*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化血管外科中心肝膽包蟲(chóng)病外科,烏魯木齊 830054;2新疆維吾爾自治區(qū)包蟲(chóng)及肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心;3新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:ranbo822116@163.com)

棘球蚴病是一種棘球蚴絳蟲(chóng)的蟲(chóng)卵感染所致的,呈世界性分布的的人畜共患疾病,嚴(yán)重危害全球衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)發(fā)展,尤其在中國(guó)西部和南美洲的牧區(qū)最為嚴(yán)重[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),病原微生物包括細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)感染,也與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2,3],目前約有200萬(wàn)惡性腫瘤病例是由病原微生物感染引起的,占全世界惡性腫瘤發(fā)生率的16.1%[4]。

研究表明,病原微生物與惡性腫瘤所產(chǎn)生的抗原,如O-糖基化抗原、Tn抗原和arc5抗原等具有許多相似性,這些共同抗原的表達(dá)為棘球蚴病與惡性腫瘤的研究提供基礎(chǔ)[5,6]。此外,實(shí)驗(yàn)證明,給荷瘤動(dòng)物模型注射寄生蟲(chóng)抗原后,相關(guān)免疫系統(tǒng)功能增強(qiáng)、免疫細(xì)胞數(shù)量增加[7],提示寄生蟲(chóng)感染合并惡性腫瘤可影響宿主免疫細(xì)胞功能狀態(tài)。Noya等[8]研究結(jié)果提示,肝囊型棘球蚴病患者囊液中所獲取的mucin-like肽具有提高宿主NK細(xì)胞數(shù)量從而影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。目前關(guān)于NK細(xì)胞在肝細(xì)胞性肝癌合并細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulosus, Eg)感染移植瘤中作用相關(guān)的研究甚少。故本研究通過(guò)HepG2細(xì)胞單獨(dú)接種和/或與Eg的原頭蚴(protoscolices, PSCs)聯(lián)合接種建立裸鼠皮下移植瘤模型檢測(cè)NK細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況,初步探討NK細(xì)胞在肝細(xì)胞性肝癌合并Eg感染裸鼠移植瘤的作用,為寄生蟲(chóng)合并惡性腫瘤的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞系購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)公司BNCC細(xì)胞庫(kù);Eg PSCs來(lái)自于新疆烏魯木齊華凌屠宰場(chǎng)中自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟,并在無(wú)菌條件下獲得。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CD16兔單克隆抗體、CD56兔多克隆抗體、NKG2D兔單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗及DAB顯色液購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;生理鹽水、PBS緩沖液、山羊血清封閉液、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液及中性樹(shù)膠購(gòu)自中國(guó)中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Trizole、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.3 Eg PSCs的收集

在無(wú)菌條件下檢查囊腫,抽吸原頭節(jié)。2 000 r/min離心2 min后棄上清。加入10 ml生理鹽水清洗3次(按上述條件離心),以10%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Eg PSCs。

1.4 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

以10%胎牛血清+1%雙抗(青霉素-鏈霉素)+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1-2 d換液,2-3 d細(xì)胞傳代。

1.5 Eg感染合并肝細(xì)胞性肝癌的裸鼠移植瘤模型建立

選取40只8-10周齡雌性BALB/c裸鼠,體質(zhì)量(15±3)g,將其隨機(jī)分為單獨(dú)移植組和聯(lián)合移植組。單獨(dú)移植組將5×106個(gè)HepG2細(xì)胞接種于裸鼠皮下;聯(lián)合移植組將5×106個(gè)HepG2細(xì)胞和2 000個(gè)Eg PSCs聯(lián)合接種于裸鼠皮下。觀察兩組裸鼠的飲食、活動(dòng)反應(yīng)及精神狀態(tài),對(duì)外界刺激的反應(yīng)。其中,腫瘤體積(V)的測(cè)量:自接種后第25天起,每4 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b),共測(cè)量5次(即接種第25,28,31,34,37天),按公式V=ab2/2計(jì)算移植瘤體積。接種37 d獲取皮下移植瘤,將一半組織經(jīng)脫水石蠟包埋用于病理染色,另一半組織凍存于-80 ℃冰箱用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.6 蘇木素伊紅(HE)染色觀察移植瘤的基本病理變化

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規(guī)脫蠟,放入蒸餾水浸洗3次×5 min,隨后浸泡蘇木素溶液1.5-2 min,立即蒸餾水沖洗至泛色,用鹽酸乙醇分化2-5 s,再放入蒸餾水反藍(lán)40-60 s后浸泡伊紅溶液1-1.5 min,蒸餾水反復(fù)沖洗至泛色,常規(guī)脫水,透明并晾干,中性樹(shù)膠封片后光學(xué)顯微鏡下觀察并收集圖像。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)NK細(xì)胞相關(guān)蛋白在移植瘤中的表達(dá)

將薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常規(guī)脫蠟,用蒸餾水沖洗3次×5 min,泡在枸櫞酸抗原修復(fù)液高溫(90-100 ℃)修復(fù)15 min,自然冷卻至室溫。PBS緩沖液沖洗3次×5 min,置于3% H2O2溶液室溫孵育10 min,PBS緩沖液沖洗3次×5 min,滴加山羊血清室溫封閉1 h后滴加一抗(CD16 1 ∶200;CD56 1 ∶100;NKG2D 1 ∶400)置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫1 h后,PBS緩沖液洗3次×5 min,滴加二抗(1 ∶2 000)室溫孵育90 min;PBS緩沖溶液沖洗3次×5 min后滴加適量DAB顯色液于光學(xué)顯微鏡下觀察顯色。蘇木精復(fù)染10-30 s,反復(fù)沖洗至泛色,浸泡鹽酸乙醇分化2-3 s后,用蒸餾水反藍(lán)40-60 s。最后常規(guī)脫水、透明、自然晾干后封固。顯微鏡下觀察并采圖,使用ImageJ軟件計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)NK細(xì)胞相關(guān)mRNA在移植瘤中的表達(dá)

用Trizole試劑提取裸鼠皮下移植瘤中的總mRNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件:25 ℃ 10 min,42 ℃ 50 min,85 ℃ 5 min。按照熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,擴(kuò)增條件設(shè)置:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次,72 ℃檢測(cè)信號(hào)。使用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算相對(duì)mRNA含量,ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因GAPDH,ΔΔCt=ΔCt聯(lián)合移植組-ΔCt單獨(dú)移植組,2-ΔΔCt表示聯(lián)合移植組目的基因mRNA的相對(duì)含量較單獨(dú)移植組所改變的倍數(shù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 皮下移植瘤的大體變化

自接種后第25天起,每4 d測(cè)量皮下移植瘤體積,共5次。結(jié)果顯示,與單獨(dú)移植組相比,聯(lián)合移植組不同接種時(shí)間移植瘤的體積明顯增大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1),表明Eg感染對(duì)HepG2細(xì)胞體內(nèi)的增殖有促進(jìn)作用。

圖1 皮下移植瘤體積的變化Figure 1 Changes of volume of subcutaneous lesions

2.2 皮下移植瘤的基本病理變化

HE染色顯示,HepG2細(xì)胞單獨(dú)移植組細(xì)胞形態(tài)和體積不均一,細(xì)胞質(zhì)嗜堿,核質(zhì)比例增加,有絲分裂活性增強(qiáng)。此外,部分細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性、凝固性壞死和空泡。Eg PSCs和HepG2細(xì)胞聯(lián)合移植組中細(xì)胞病理變化更為明顯,并可見(jiàn)典型的Eg PSCs結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2)。

黑色箭頭表示脂肪變性,藍(lán)色箭頭表示空泡樣變化,黃色箭頭表示凝固性壞死,紅色箭頭表示Eg PSCs結(jié)構(gòu)圖2 皮下移植瘤的基本病理變化Figure 2 Basic pathological changes of subcutaneous lesions

2.3 CD16陽(yáng)性NK細(xì)胞在皮下移植瘤中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,CD16陽(yáng)性NK細(xì)胞主要定位于皮下移植瘤組織,呈棕褐色。定量結(jié)果顯示,Eg PSCs和HepG2細(xì)胞聯(lián)合移植組CD16陽(yáng)性NK細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于HepG2細(xì)胞單獨(dú)移植組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,聯(lián)合移植組中CD16 mRNA表達(dá)量較單獨(dú)移植組明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

2.4 CD56陽(yáng)性NK細(xì)胞在皮下移植瘤中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,CD56陽(yáng)性NK細(xì)胞主要定位于皮下移植瘤組織,呈棕褐色。定量結(jié)果顯示,Eg PSCs和HepG2細(xì)胞聯(lián)合移植組CD56陽(yáng)性NK細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于HepG2細(xì)胞單獨(dú)移植組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,聯(lián)合移植組中CD56 mRNA表達(dá)量較單獨(dú)移植組明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

箭頭表示CD16陽(yáng)性NK細(xì)胞;與單獨(dú)移植組(HepG2)相比,*P<0.05圖3 CD16陽(yáng)性NK細(xì)胞在皮下移植瘤中的表達(dá) (×200)Figure 3 Expression of CD16 positive NK cells in the subcutaneous lesions (×200)

箭頭表示CD56陽(yáng)性NK細(xì)胞;與單獨(dú)移植組(HepG2)相比,*P<0.05圖4 CD56陽(yáng)性NK細(xì)胞在皮下移植瘤中的表達(dá) (×200)Figure 4 Expression of CD56 positive NK cells in the subcutaneous lesions (×200)

2.5 NKG2D在皮下移植瘤中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,NK細(xì)胞分泌的NKG2D主要定位于皮下移植瘤組織,呈棕褐色。定量結(jié)果顯示,Eg PSCs和HepG2細(xì)胞聯(lián)合移植組NKG2D陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于HepG2細(xì)胞單獨(dú)移植組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,聯(lián)合移植組中NKG2D mRNA表達(dá)量較單獨(dú)移植組明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

箭頭表示NKG2D陽(yáng)性細(xì)胞;與單獨(dú)移植組(HepG2)相比,*P<0.05圖5 NKG2D在皮下移植瘤中的表達(dá) (×200)Figure 5 NKG2D expression in the subcutaneous lesions (×200)

3 討論

寄生蟲(chóng)感染與惡性腫瘤之間存在密切的關(guān)系。寄生蟲(chóng)感染后隨著血流到達(dá)全身各個(gè)部位寄生,導(dǎo)致宿主免疫力下降從而引起各種疾病的發(fā)生。此外,寄生蟲(chóng)感染所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或分泌的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子對(duì)宿主微環(huán)境產(chǎn)生細(xì)胞毒素作用,并誘導(dǎo)某些類(lèi)型惡性腫瘤發(fā)生[9,10]。相反,在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,腫瘤特異性抗原在體內(nèi)被降解為小片段,通過(guò)影響宿主免疫系統(tǒng)和免疫細(xì)胞功能狀態(tài)從而引起各種感染性疾病的發(fā)生[11,12]。在臨床工作中寄生蟲(chóng)感染合并惡性腫瘤患者十分罕見(jiàn),但由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)和特征,大多數(shù)患者未及時(shí)發(fā)現(xiàn)并到中晚期才尋求治療,對(duì)這些患者來(lái)說(shuō)手術(shù)和藥物治療效果均較差。因此,開(kāi)展寄生蟲(chóng)感染合并惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的研究顯得尤為重要。

研究表明,與肝惡性腫瘤患者相比(中位生存時(shí)間6個(gè)月),囊型棘球蚴病合并肝惡性腫瘤患者生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(中位生存時(shí)間17個(gè)月),提示Eg感染與肝惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間存在明確的相關(guān)性[13]。此外,體外采用Eg PSCs和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),Eg PSCs能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,這可能與Eg PSCs分泌一些細(xì)胞因子有關(guān)[14]。Eg侵入中間宿主后引起機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生一些變化從而逐漸形成病理性的免疫逃避機(jī)制。其中,NK細(xì)胞作為重要的固有免疫細(xì)胞參與T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)的過(guò)程,引起Eg病灶微環(huán)境免疫狀態(tài)的改變[15,16]。此外,囊液中的分泌物通過(guò)改變宿主NK細(xì)胞數(shù)量和功能狀態(tài)對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。由于體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)體系未考慮到免疫系統(tǒng)的作用,因此需要開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討Eg感染對(duì)肝惡性腫瘤的影響以及闡明宿主免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)中采用Eg PSCs和HepG2細(xì)胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,結(jié)果顯示,在聯(lián)合移植組中皮下移植瘤體積較單獨(dú)移植組明顯增大,提示Eg感染在體內(nèi)促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖,這與近期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[17]。研究表明,寄生蟲(chóng)感染和惡性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中,通過(guò)高表達(dá)免疫抑制性NKG2A導(dǎo)致NK細(xì)胞功能的耗竭和機(jī)體免疫耐受,從而影響疾病的轉(zhuǎn)歸[18,19]。我們免疫組織化學(xué)染色和qRT-pCR結(jié)果顯示,與單獨(dú)HepG2細(xì)胞移植組相比,在聯(lián)合移植組中CD16、CD56、NKG2D等NK細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量明顯增加,表明Eg感染后NK細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)免疫抑制性分子處于免疫耗竭的狀態(tài)從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞體內(nèi)的增殖。

總之,NK細(xì)胞作為重要的固有免疫細(xì)胞可能參與Eg感染引起的HepG2細(xì)胞增殖過(guò)程。隨著對(duì)Eg病灶和腫瘤微環(huán)境認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步加深,研究免疫細(xì)胞在Eg感染合并惡性腫瘤的作用及其可能的機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義,靶向Eg與惡性腫瘤共同抗原或Eg代謝產(chǎn)物有望成為治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)。