下調(diào)PTEN促進(jìn)肝癌抑制性腫瘤免疫微環(huán)境形成

傅 瀟,田 濤,向蘿成玲,劉夢(mèng)潔,姜麗麗,王文娟,梁 璇,阮之平,姚 煜

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:136690205@qq.com)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,最新數(shù)據(jù)顯示,肝癌死亡率占惡性腫瘤死亡率的第4位[1]。在我國,每年約有42萬人死于肝癌,位居惡性腫瘤第2位[2]。原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最主要的病理類型,具有起病隱匿,預(yù)后差,病情發(fā)展迅速、臨床效果不佳等特點(diǎn)。雖然免疫檢查點(diǎn)抑制劑,即PD-1/PD-L1單抗的出現(xiàn)為晚期肝癌治療提供了新的思路和選擇,但是有限的療效只能使部分患者獲益[3,4]。因此,明確肝癌腫瘤微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制,是提高肝癌免疫治療應(yīng)答的關(guān)鍵。

PTEN全稱為磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog),于1997年被發(fā)現(xiàn)[5],PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性拮抗磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶B(PKB,又稱Akt)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)途徑,控制細(xì)胞的多種生物學(xué)過程,包括存活、增殖和能量代謝等[6,7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),低表達(dá)PTEN不僅促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展[8,9],而且通過促進(jìn)血管生成[10]和上皮間質(zhì)化生[11],調(diào)控肝癌腫瘤微環(huán)境形成。既往研究發(fā)現(xiàn),PTEN表達(dá)缺失導(dǎo)致殺傷性T細(xì)胞數(shù)量減少和殺傷能力下降[12];通過異常激活PI3K/Akt通路引起PD-L1表達(dá)升高[13],從而引起腫瘤免疫耐受。但是,在肝癌中,PTEN與免疫微環(huán)境形成的關(guān)系尚未明確。在本研究中,我們擬通過構(gòu)建小鼠皮下移植瘤模型,利用PTEN siRNA降低PTEN表達(dá),以探索PTEN在肝癌腫瘤免疫微環(huán)境形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HePa1-6細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素溶液和胎牛血清購自美國Hyclone生物公司,胰蛋白酶和乙二胺四乙酸購自上海亨代勞商貿(mào)有限公司,總RNA極速抽提試劑盒Fast200TM購自北京天根生物有限公司,TAKARA PrimeScriptTMRT Master Mix和SYRB?Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本Takara公司,PTEN、CD8、Foxp3、PD-L1、ICOS和IDO抗體及免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物有限公司。CD4和CD25抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 小鼠皮下移植瘤構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)小鼠C57BL/6用于構(gòu)建小鼠同種皮下移植瘤模型。選取生長良好的HePa1-6細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)48 h,常規(guī)胰酶/EDTA消化制成單細(xì)胞懸液,將Matrigel和無血清DMEM培養(yǎng)基按照1 ∶1比例重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/ml;將10只4周齡C57BL/6小鼠常規(guī)消毒后,在其背側(cè)皮下注射100 μl細(xì)胞懸液;觀察移植瘤生長情況,用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長徑(L)和短徑(W),按公式(L×W2/2)計(jì)算出腫瘤近似體積;細(xì)胞懸液注射后約1周,待腫瘤體積約為150 mm3(皮下可觸及)時(shí),隨機(jī)將小鼠分為siRNA NC和PTEN siRNA組,分別皮下注射siRNA NC和PTEN siRNA;每周注射2次,干預(yù)3周后處死小鼠,獲得組織標(biāo)本。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤組織中CD8、Foxp3、PD-L1、IDO和ICOS的表達(dá)

切片二甲苯脫蠟,梯度酒精和純水水化;切片置于抗原修復(fù)液中,微波爐進(jìn)行抗原修復(fù);標(biāo)本置于3%H2O2中室溫孵育,后用山羊血清封閉,封閉后洗滌封閉液;滴加稀釋的CD8、Foxp3、PD-L1、IDO或ICOS的一抗工作液,室溫孵育后置于濕盒內(nèi)4 ℃過夜;洗滌一抗,滴加相應(yīng)的生物標(biāo)記二抗并于室溫孵育30 min,之后洗滌二抗;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素,室溫孵育后洗滌;二氨基聯(lián)本胺和H2O2孵育,自來水充分沖洗終止顯色反應(yīng);蘇木素復(fù)染;梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.4 免疫熒光檢測(cè)移植瘤組織中CD4和CD25的表達(dá)

切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)和封閉步驟同免疫組化。封閉后洗滌封閉液,滴加稀釋的CD4、CD25的一抗工作液;室溫孵育后置于濕盒內(nèi)4 ℃過夜;洗滌一抗,滴加相應(yīng)的熒光二抗并于室溫避光孵育60 min;沖掉二抗,放在切片架上,PBS洗滌;滴加DAPI至完全覆蓋組織以復(fù)染核8 min,PBS洗滌;擦干組織周圍液體,膠頭滴管滴加半滴抗熒光淬滅劑,蓋玻片封片。

1.5 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和real-time qPCR檢測(cè)PTEN mRNA表達(dá)

組織RNA提取:稱取移植瘤組織質(zhì)量并記錄,將移植瘤組織剪切成小塊后放入預(yù)冷的平皿中的鋼網(wǎng)上,加入生理鹽水(約1 ml/30 mg組織),用研磨棒將組織研磨擠壓過鋼網(wǎng),收集過網(wǎng)懸液,取100 μl過濾液加入Eppendorf管,按照Fast200TM試劑盒說明書提取RNA,將提取的RNA置于-80 ℃保存。

逆轉(zhuǎn)錄和real-time qPCR:分別根據(jù)TAKARA PrimeScriptTMRT Master Mix和SYRB?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行,利用real-time qPCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光擴(kuò)增,GAPDH作為管家基因,轉(zhuǎn)入siRNA NC組作為對(duì)照,采用2-ΔΔCt法分析PTEN的相對(duì)表達(dá)量(引物序列見表1)。

表1 PTEN siRNA和siRNA NC序列、PTEN和GAPDH引物序列

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫中Foxp3、PD-L1、IDO、ICOS、IFNAR1和IFNAR2的表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)通過FIREHOSE Broad GDAC(http://gdac.broadinstitute.org/)獲取。分析TCGA數(shù)據(jù)庫中365例肝癌患者PTEN與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性。根據(jù)PTEN表達(dá)的中位數(shù),將365名肝癌患者分為PTEN高表達(dá)和低表達(dá)組。利用level 3 Illumina RNA-Seq and miRNA-Seq數(shù)據(jù),經(jīng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且兩組總體方差相等后,應(yīng)用Student-t檢驗(yàn)分析PTEN高表達(dá)組和低表達(dá)組中Foxp3、PD-L1、IDO、ICOS、IFNAR1和IFNAR2的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。經(jīng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且兩組總體方差相等后，應(yīng)用studentt檢驗(yàn)比較兩組間差異。以雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)PTEN促進(jìn)移植瘤生長

通過qPCR和IHC均發(fā)現(xiàn),與siRNA NC組相比,PTEN siRNA組移植瘤中PTEN在mRNA和蛋白層面的表達(dá)均較siRNA NC組顯著降低(P<0.05,見圖1)。PTEN siRNA組的移植瘤生長速率顯著高于siRNA NC組(P<0.05,見圖2)。提示PTEN siRNA下調(diào)移植瘤中PTEN的表達(dá),并促進(jìn)移植瘤增殖。

與siRNA NC組比較，**P<0.01圖1 PTEN siRNA下調(diào)PTEN表達(dá)Figure 1 PTEN siRNA reduces PTEN expression

與siRNA NC比較,*P<0.05圖2 下調(diào)PTEN促進(jìn)移植瘤生長Figure 2 Down-regulation of PTEN expression promotes subcutaneous tumor growth

2.2 下調(diào)PTEN促進(jìn)肝癌移植瘤的抑制性腫瘤免疫微環(huán)境形成

結(jié)果顯示:與siRNA NC組相比,PTEN siRNA組的移植瘤中CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤顯著減少(P=0.008),而Foxp3+和CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞顯著增多(P<0.05,見圖3)。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn):PTEN siRNA組的移植瘤中PD-L1、ICOS和IDO的表達(dá)顯著升高(P<0.05,見圖4)。說明下調(diào)PTEN后,小鼠移植瘤中免疫微環(huán)境呈抑制狀態(tài)。

與siRNA NC比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 注入PTEN siRNA和siRNA NC后IHC檢測(cè)小鼠移植瘤中CD8+T細(xì)胞、Foxp3+T細(xì)胞的分布,IF檢測(cè)CD4+CD25+T細(xì)胞的分布Figure 3 The distribution of CD8+T cells, Foxp3+T cells by IHC, and CD4+CD25+T cells by IF in subcutaneous tumors injected with PTEN siRNA and siRNA NC

與siRNA NC比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 注入PTEN siRNA和siRNA NC后應(yīng)用IHC檢測(cè)小鼠移植瘤中PD-L1、ICOS和IDO的表達(dá)Figure 4 The expression of PD-L1, ICOS and IDO in subcutaneous tumors injected with PTEN siRNA and siRNA NC by IHC

2.3 PTEN與PD-L1、IDO、Foxp3、IFNAR1和IFNAR2在TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫中表達(dá)相關(guān)性

TCGA數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在PTEN高表達(dá)患者中PD-L1、Foxp3、ICOS和IDO的表達(dá)水平均低于低表達(dá)患者;而IFNAR1和IFNAR2在PTEN高表達(dá)患者中的表達(dá)顯著高于低表達(dá)患者(P<0.05,見表2)。

表2 PD-L1、Foxp3、ICOS、IDO、IFNAR1和IFNAR2在PTEN高表達(dá)和低表達(dá)患者中的表達(dá)

3 討論

本課題組的既往研究提示PTEN通過增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和血管生成能力,促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展和肝癌耐藥的發(fā)生[8-11],而PTEN和肝癌免疫微環(huán)境的研究仍十分有限。基于本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的PTEN能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化生,促進(jìn)肝癌細(xì)胞外泌體分泌[11],影響腫瘤微環(huán)境,本研究以期進(jìn)一步明確PTEN與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性。

腫瘤浸潤性CD8+T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫中負(fù)責(zé)殺傷腫瘤的關(guān)鍵淋巴細(xì)胞,其浸潤程度提示了腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)答效應(yīng)。而Foxp3+T細(xì)胞,又稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)則調(diào)控了免疫平衡。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,與CD8+T淋巴細(xì)胞的殺傷腫瘤作用相反,Foxp3+T細(xì)胞則參與了免疫逃逸,并促進(jìn)抑制性免疫微環(huán)境形成,引起腫瘤發(fā)生發(fā)展。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中,低豐度的CD8+T細(xì)胞與骨轉(zhuǎn)移相關(guān),而Foxp3+T細(xì)胞的聚集則與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[14];在接受新輔助化療的乳腺癌患者中,高CD8/Foxp3比值提示較好的預(yù)后[15]。

Huynh等[16]的研究證實(shí),PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路參與了Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和譜系穩(wěn)定性的調(diào)控。在腫瘤免疫中,PTEN也被證實(shí)與Foxp3+T細(xì)胞浸潤相關(guān),并提示預(yù)后:低表達(dá)的PTEN和腫瘤中富集的CD4+Foxp3+T細(xì)胞浸潤被證實(shí)與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)[17]。不僅如此,在骨肉瘤中,低表達(dá)的PTEN不僅通過增加腫瘤Foxp3+T細(xì)胞的浸潤,而且還通過上調(diào)PD-L1表達(dá),誘導(dǎo)骨肉瘤抑制性免疫微環(huán)境形成[18]。

基于此,本課題在構(gòu)建的小鼠移植瘤模型中檢測(cè)了CD8+T細(xì)胞、Foxp3+和CD4+CD25+T細(xì)胞的分布和PD-L1表達(dá),并發(fā)現(xiàn)下調(diào)PTEN引起腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞減少,而Foxp3+和CD4+CD25+T細(xì)胞增多,且PD-L1表達(dá)上調(diào)。除外腫瘤浸潤性T細(xì)胞和PD-L1的表達(dá),越來越多的腫瘤免疫標(biāo)志物受到關(guān)注。與PD-L1相似,IDO和ICOS也在腫瘤免疫微環(huán)境形成中起到了抑制作用。本課題在下調(diào)PTEN的移植瘤中發(fā)現(xiàn)IDO和ICOS表達(dá)高,提示下調(diào)PTEN引起抑制性腫瘤免疫微環(huán)境的發(fā)生。

IFNAR1和IFNAR2是I型干擾素受體。干擾素只有與其受體結(jié)合后才能發(fā)揮腫瘤殺傷效應(yīng),IFNAR1和IFNAR2的表達(dá)與T細(xì)胞浸潤正相關(guān)[19],提示了腫瘤免疫激活程度。為了進(jìn)一步明確PTEN與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性,本課題在TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫中分析結(jié)果提示,IFNAR1和IFNAR2在PTEN低表達(dá)的患者中顯著低于PTEN高表達(dá)的患者,提示低表達(dá)PTEN削弱了殺傷性T細(xì)胞的功能。

綜上所述,本課題通過本研究在動(dòng)物體內(nèi)和公共數(shù)據(jù)庫證實(shí)了低表達(dá)PTEN誘導(dǎo)了肝癌抑制性免疫微環(huán)境的形成。因此,恢復(fù)PTEN表達(dá)不僅可以抑制肝癌發(fā)生,還能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸。