R848 處理小鼠精子對(duì)胚胎性別比率的影響

周正娜，唐小云，周桂珍，鄧雅迪，張欣如，張 慧，阿里木江·喀迪爾，王旭光*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000；2.阿克蘇地區(qū)沙雅縣草原工作站，新疆阿克蘇 842200）

性別控制技術(shù)能夠加速家畜繁殖育種進(jìn)程，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展產(chǎn)生巨大社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。目前性別控制主要通過(guò)兩種途徑，一種是X/Y 精子分離，另一種是通過(guò)早期胚胎進(jìn)行性別鑒定[1]?，F(xiàn)有的性控技術(shù)各有利弊，不能廣泛應(yīng)用于我國(guó)實(shí)際生產(chǎn)。R848 作為T(mén)LR7/8 有效激動(dòng)劑，介導(dǎo)粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]，主要具有免疫調(diào)節(jié)作用，被推薦用于治療皮膚病、抗病毒和抗腫瘤局部藥物[3]，也被開(kāi)發(fā)作為一種有效的疫苗佐劑[4]。近年，日本有研究發(fā)現(xiàn)，將TLR7/TLR8 的配體R848 加入精子培養(yǎng)基中，可以改變精子因自身產(chǎn)生的能量差異形成有運(yùn)動(dòng)差異的攜帶X 染色體的精子（X 精子）和攜帶Y 染色體的精子（Y 精子），且使用處理的精子進(jìn)行體外受精后獲得性別比例偏斜高的雌雄后代[5]，之后作者使用該體系分離牛凍精并獲得相似結(jié)果[6]。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)全世界哺乳動(dòng)物輔助生殖、繁殖性能、經(jīng)濟(jì)等具有極大益處，但國(guó)內(nèi)還未建立這種新型分離技術(shù)。本研究以小鼠為動(dòng)物模型，建立簡(jiǎn)捷方便、省時(shí)高效且易操作的分離體系，繼而通過(guò)成熟的PCR性別鑒定體系鑒定所獲早期胚胎的性別，篩選出R848處理精子分層的最佳濃度，為后續(xù)大型家畜后代性別控制技術(shù)的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體重在25～28 g 性成熟的昆明白小鼠，保證每日光照時(shí)間達(dá)到14 h，且在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)2 周以上。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）為寧波第二激素廠產(chǎn)品，礦物油、乳酸鈉（C3H5O3Na）、氯化鈉（NaCl）、二水氯化鈣（CaCl2·2H2O）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、葡萄糖（C6H12O6）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、丙酮酸鈉（C3H3NaO3）、牛血清白蛋白（BSA）、R848、胚胎用水等其他藥品為Merck 公司產(chǎn)品，蛋白酶K、2×San Taq PCR mix 預(yù)混液為生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品，ddH2O 為天根生物科技有限公司產(chǎn)品，瓊脂糖為西班牙Biowest 產(chǎn)品。精子不同階段培養(yǎng)基（HTF 培養(yǎng)基、mHTF 培養(yǎng)基）和KSOM 培養(yǎng)基固定配方見(jiàn)表1。

表1 不同階段培養(yǎng)基的組成

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 據(jù)NCBI 中小鼠的基因序列及PCR 引物設(shè)計(jì)原則，利用Oligo 7.0 軟件，設(shè)計(jì)性別鑒定特異性基因的PCR 引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表2。

表2 性別鑒定基因引物信息

1.1.3 主要儀器 實(shí)驗(yàn)儀器主要包括二氧化碳培養(yǎng)箱Fisher Scientific LS-CO150、體視顯微鏡OLYMPUS SZ-61、倒置顯微鏡OLYMPUS IX71、Eppendorf Mini高速離心機(jī)、HIT TPSE-2 電熱恒溫板、邁朗計(jì)算機(jī)精子分析儀ML-608JZIII、Eppendorf PCR 儀、凝膠電泳儀DYCP-31DN/CN（北京六一生物科技有限公司）、TGreen 切膠儀OSE-470。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精液的采集與處理 選取8 周齡、合籠見(jiàn)栓后3～7 d 的雄鼠斷頸處死，無(wú)菌條件下固定附睪尾，用1 mL 注射器針頭在附睪尾集中扎孔使精子溢出，收集精液，置于已平衡過(guò)夜的mHTF 液（100 μL）中，37℃孵育5～8 min；待精子完全擴(kuò)散后，離心（1 900 r/min，3 min）棄去上清，將濃縮精液分別加入含不同濃度（0、0.3、1、3 μmol/L）R848 培養(yǎng)基組中，37℃孵育60 min。

上層精子的處理：分別吸取各濃度組的最上層60 μL 精液置于新的Ep 管內(nèi)，并添加100 μL 無(wú)配體的mHTF 培養(yǎng)基進(jìn)行輕微吹吸，做好標(biāo)記迅速離心（1 900 r/min，3min），隨即棄去上清液（約130 μL），沉淀（25～30 μL）待調(diào)整精子密度（精子個(gè)數(shù)為1×106～5×106個(gè)）重懸后進(jìn)行體外受精。

下層精子的處理：分別吸取各濃度組最底層30 μL精液置于新的Ep 管內(nèi)，并迅速在上方補(bǔ)100 μL 無(wú)配體mHTF 培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min 后收集上層活力較好的精液（100 μL），1 900 r/min離心3 min 棄上清，調(diào)整沉淀（25～30 μL）的精子密度（精子個(gè)數(shù)為1×106～5×106為宜）。

1.2.2 體外受精 雌鼠腹腔注射PMSG 48 h 時(shí)再次注射hCG，13 h 后，從輸卵管中獲取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體置于HTF 培養(yǎng)基液滴中，將各組調(diào)整過(guò)密度的精液吸取15～25 μL 加入受精滴中，精卵孵育5 min 后于倒置顯微鏡下觀察精子能夠推動(dòng)裸卵（外圍無(wú)顆粒細(xì)胞包圍）做轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)，酌情增補(bǔ)精液量。精卵孵育6 h 后，以形成原核為受精標(biāo)志，判斷受精情況并統(tǒng)計(jì)受精率，并將帶有雌雄原核的受精卵30 枚/滴置于KSOM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)（37℃，5% CO2，飽和濕度）。受精24 h后統(tǒng)計(jì)卵裂至2-cell 胚數(shù)并計(jì)算卵裂率，96 h 后檢取囊胚并統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.2.3 性別鑒定

1.2.3.1 早期胚胎樣品的保存 將發(fā)育至囊胚的早期胚胎以每枚胚胎加4 μL 1×PCR Buffer 的形式裝入PCR 管中，做好標(biāo)記置于-20℃冷凍儲(chǔ)存。

1.2.3.2 DNA 的提取 采用蛋白酶K 消化法[7]，每個(gè)胚胎樣品添加0.2 μL 10×PCR Buffer和1.8 μL蛋白酶K進(jìn)行旋渦混勻并短暫離心，使樣品和液體均沉入試管底部，放入PCR 儀中，設(shè)置消化程序：65℃，30 min 消化，95℃，15 min，蛋白酶K 變性，即獲得早期胚胎DNA模板，可4℃短期保存。

1.2.3.3 PCR 擴(kuò)增及電泳 取3 μL 樣品DNA 模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，20 μL 擴(kuò)增體系：2×PCR mix 10 μL、SRY和ZFX 引物（濃度為10 μmol/L）上下游各0.4 μL，補(bǔ)ddH2O 5.4 μL，隨后置于PCR 儀中并運(yùn)行擴(kuò)增程序（95℃、5 min，95℃、30 s，59℃、30 s，72℃、40 s，72℃、10 min，4℃、∞，35 個(gè)循環(huán)）。取8 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，最后收集電泳凝膠，在凝膠成像儀中進(jìn)行觀察、拍照。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 受精能力及早期發(fā)育 取濃縮精液分別加入已制備好的0、0.3、1、3 μmol/L R848 培養(yǎng)基中，孵育60 min后，分別獲取上下層精液并經(jīng)清洗、離心，調(diào)整精子密度，對(duì)體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，受精6、24、96 h 分別統(tǒng)計(jì)發(fā)育情況。

1.3.2 早期胚胎性別鑒定 受精96 h 后收集各組囊胚提取每枚囊胚的DNA，以SRY 和ZFX 基因構(gòu)建的PCR擴(kuò)增體系來(lái)鑒定單個(gè)囊胚的性別。

1.3.3 精子活力、運(yùn)動(dòng)參數(shù) 取重懸精液分別加入已制備好的含不同濃度R848 的培養(yǎng)基中，孵育60 min 后，獲取上下層精液并經(jīng)清洗、離心，調(diào)整精子密度后，取10 μL 精液滴于精子計(jì)數(shù)板中，并迅速置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的邁朗計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀下進(jìn)行觀察評(píng)價(jià)。同一濃度重復(fù)4 次，每次取10 個(gè)觀察視野。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件初步進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)，用SPSS 23.0 中的χ2進(jìn)行精子受精能力、早期胚胎性別比率分析，用SPSS 23.0 中的單因素方差，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度R848 處理對(duì)精子受精功能的影響 由表3 可 知，0.3 μmol/L R848 組、1 μmol/L R848 組卵裂率低于對(duì)照組（P＜0.01）；R848 各濃度組所獲囊胚率間差異不顯著。

表3 不同濃度R848 處理精子后上層精液對(duì)卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表4 可知，R848 各濃度組的受精率均極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），同時(shí)1、3 μmol/L R848 組受精率低于0.3 μmol/L R848 組（P＜0.01）；0.3 μmol/L R848組囊胚率高于對(duì)照組和1、3 μmol/L R848 組（P＜0.01）。因此，孵育處理小鼠精液R848 的最佳添加濃度為0.3 μmol/L。

表4 不同濃度R848 處理精子后下層精液對(duì)卵母細(xì)胞體外受精的影響

2.2 各濃度組所獲早期胚胎性別比率的對(duì)比 各實(shí)驗(yàn)組上層精液體外受精96 h 后收集的囊胚通過(guò)性別鑒定（圖1）。0.3、1 μmol/L R848 組上層所獲雌雄胚胎比率（XY:XX）均高于對(duì)照組（P＜0.01），但0.3 μmol/L R848 組與1 μmol/L R848 組之間差異不顯著（表5）。

圖1 早期胚胎PCR 性別鑒定結(jié)果圖

表5 不同濃度R848 處理精子后上層精液體外受精所獲早期胚胎性別比率

由表6 可知，各實(shí)驗(yàn)組下層精液進(jìn)行體外受精96 h后收集囊胚鑒定性別，0.3 μmol/L R848 組下層精液所獲雌雄胚胎比率（XY:XX）和3 μmol/L R848 組下層精液所獲雌雄胚胎比率（XY:XX）均高于對(duì)照組（P＜0.05）；1 μmol/L R848 組與各組差異不顯著。

表6 不同濃度R848 處理精子后下層精液體外受精所獲早期胚胎性別比率

因此，0.3 μmol/L R848 組孵育處理分離的上、下層精液進(jìn)行體外受精后，早期胚胎性別比例偏斜效果最佳。

2.3 各濃度組精子活力、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響 由表7 可知，實(shí)驗(yàn)組上、下層精子活力、活率較對(duì)照組均降低（P＜0.01）；隨著R848 濃度升高平均路徑速度（VAP）和曲線速度（VCL）均降低（P＜0.05），R848 各濃度組下層精液精子的直線速度（VSL）低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表7 不同濃度R848 的處理對(duì)上、下層精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

3 討 論

通常情況下，精子不受外界影響，精子獲能狀態(tài)越好，受精率越高，獲得的早期胚胎數(shù)量也相應(yīng)較多，反之受精率較低，胚胎發(fā)育可能受到損害[8]。糖酵解[9]和線粒體[10]是精子獲能與受精過(guò)程中的兩個(gè)重要途徑，一個(gè)參與誘導(dǎo)精子獲能，另一個(gè)使精子保持線性運(yùn)動(dòng)，增加受精能力。本研究結(jié)果表明，當(dāng)R848 的添加濃度在1 μmol/L 和3 μmol/L 時(shí)極顯著降低精子活力，受精率也降低；但與相較高濃度處理相比，添加濃度較低時(shí)（0.3 μmol/L）對(duì)受精率、活力的影響較小，可能與其糖酵解受抑制減少ATP 的產(chǎn)生或抑制線粒體活性影響精子運(yùn)動(dòng)有關(guān)，但各實(shí)驗(yàn)組受精卵均正常發(fā)育至囊胚，進(jìn)一步說(shuō)明該體系下添加R848 能夠降低精子活力，但在功能、基因表達(dá)上并未受限。TLR 作為一種模式識(shí)別受體，近年發(fā)現(xiàn)TLR7/8 配體R848 能夠激活位于精子中部的TLR8 抑制線粒體活性，激活精子尾部TLR7 抑制細(xì)胞質(zhì)糖酵解[5]。Shi 等[11]也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，TLR激活將導(dǎo)致精子線粒體功能失調(diào)，從而降低精子活力，R848 激活的TLR 受體能夠抑制小鼠和人類精子受精能力。值得注意的是，R848 高濃度組下層精子較上層所獲精子受精率更低，由此推測(cè)R848 僅激活了部分精子，產(chǎn)生的精子受精率具有極大差異，這也有可能是發(fā)現(xiàn)了X 精子與Y 精子的生理差異。Umehara 等[5]報(bào)道TLR7/8 在一半的精子中有所表達(dá)，R848 激活相應(yīng)精子的受體，并顯著降低這類精子的受精能力。

成熟精子在受精過(guò)程中需要消耗大量ATP，為精子提供能量產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)TLR7/8 激活介導(dǎo)精子活性變化的機(jī)制是由ATP 的產(chǎn)生直接調(diào)解[14]。本研究結(jié)果表明，相較其他高濃度R848，在培養(yǎng)基中添加0.3 μmol/L R848 對(duì)精子VAP、VCL 的影響較小，且同濃度下層精子較上層精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)較低。楊偉娜[15]提出提高人精子的VAP、VCL、VSL 等運(yùn)動(dòng)指標(biāo)可以增強(qiáng)精子與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合能力，以提高受精率。這可能是TLR7/8 的激活降低了精子ATP 的生成，從而影響精子活力，這不僅是造成受精率低的原因之一，也可能是造成精子分層的主要原因。

對(duì)性別化精液進(jìn)行體外受精后所獲的胚胎進(jìn)行檢驗(yàn)，目前準(zhǔn)確率最高的方法為PCR 性別鑒定技術(shù)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用不同濃度配體孵育分離精子，獲得的上層精液進(jìn)行體外受精后，XY 胚胎比率極顯著增高，對(duì)應(yīng)下層精液進(jìn)行體外受精后，XX 胚胎數(shù)顯著增多，說(shuō)明在本處理體系下，X 精子與Y 精子產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)差異，導(dǎo)致Y 精子大量活動(dòng)于上層，X 精子運(yùn)動(dòng)于下層，由此驗(yàn)證R848 的激活減緩了X 精子的運(yùn)動(dòng)能力。國(guó)外最新報(bào)道，添加0.3 μmol/L R848 處理牛凍精后，上層精液進(jìn)行體外受精所獲XY 胚胎比率達(dá)90% 以上，下層精液所獲XX 胚胎比率超過(guò)80%[6]。這與本實(shí)驗(yàn)胚胎性別比例偏轉(zhuǎn)方向相同。進(jìn)一步說(shuō)明R848 處理的精子能夠產(chǎn)生具有運(yùn)動(dòng)差異的X/Y 精子，同時(shí)不影響精子的功能及獲得性別比例偏斜的后代。這也可能是發(fā)現(xiàn)X精子與Y 精子生理差異的突破點(diǎn)?？赡芤虺鰪S藥品差異、處理體系差異或?qū)嶒?yàn)室等條件差異，本實(shí)驗(yàn)中XY 胚胎僅達(dá)到近65% 的偏斜比例，還需進(jìn)一步優(yōu)化各方面條件，改善R848 分離X/Y 精子模型，進(jìn)一步提高后代的雌雄偏斜比率。依據(jù)TLR7/8 配體激活在性控化精液方向有很大的應(yīng)用前景，可以適應(yīng)哺乳動(dòng)物生殖技術(shù)，能夠在較短時(shí)間致使X/Y 精子分層，成本較低，耗時(shí)較短。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，添加R848 孵育小鼠精液能夠使精子形成有運(yùn)動(dòng)差異的X/Y 精子，并獲得雌雄比例偏斜的后代，其中濃度為0.3 μmol/L 時(shí)分離效果最佳；且整個(gè)分離過(guò)程用時(shí)較短，分離步驟易操作，無(wú)需高成本儀器，可適用于其他家畜在實(shí)際生產(chǎn)中性別化精液的快速分離。