穗花杉雙黃酮的生理功能及作用機制研究進展

李柏珍，胡睿智，諶 暉，伍樹松,2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.湖南省畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128）

動物在生長過程中不可避免地會受到飼養(yǎng)環(huán)境、日糧變化、病原體等外界不良因素的刺激引起腸道功能失調(diào)、代謝紊亂等一系列病理變化，從而導致畜禽生長發(fā)育受阻、抗病能力下降，影響生產(chǎn)性能及養(yǎng)殖效益[1]。傳統(tǒng)飼養(yǎng)過程中主要依靠抗生素來改善這些問題，但長期大規(guī)模使用抗生素帶來的抗藥殘留及環(huán)境污染等危害已嚴重影響到人類的健康和安全。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號公告規(guī)定自2020 年開始“退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑”。在此背景下，開發(fā)綠色、安全、無公害的飼料及添加劑產(chǎn)品迫在眉睫。植物活性成分具有抗氧化、抗炎、抑菌、提高動物機體免疫力等多種功效[2]，且不會造成藥物殘留和環(huán)境污染等問題，因此在畜禽生產(chǎn)上有巨大的應用價值。穗花杉雙黃酮（Amentoflavone）是卷柏屬植物中主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌等多種生物學功能，已在醫(yī)藥、保健等領域有所應用[3-5]，有望在畜禽生產(chǎn)中得以開發(fā)利用。本文就穗花杉雙黃酮的生理功能及其在畜禽生產(chǎn)中的應用前景進行綜述，為其在新型飼料及添加劑中的應用提供理論依據(jù)與參考。

1 穗花杉雙黃酮

穗花杉雙黃酮又稱阿曼托黃酮，是一種在植物界中分布極為廣泛的黃酮類物質(zhì)，分子式為C30H18O10，分子量為538.46，熔點為256℃，是一種由C30連接的芹菜素二聚體，其結(jié)構式見圖1。

圖1 穗花杉雙黃酮結(jié)構式

1.1 穗花杉雙黃酮的來源 穗花杉雙黃酮以卷柏科卷柏屬[Selaginella tamariscina（Beauv.）Spring]植物中含量最高。我國的穗花杉雙黃酮資源豐富，常見的卷柏科卷柏屬植物有卷柏（Selaginella tamariscina）、墊狀卷柏（Selaginella pulvinata）、深綠卷柏（Selaginella doederleinii）、江南卷柏（Selaginella moelledndorffii）、翠云草（Selaginella uncinata）等70 余種[6]，廣泛分布于我國東北、華北、華東、中南及陜西、四川等地。孫冬梅等[7]利用HPLC 法對11 種卷柏屬植物中穗花杉雙黃酮的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)二型卷柏（S.biformis A.Br.）、兗州卷柏（S.involvens（Sw.）Spring）和江南卷柏（S.moellendorfii Hieron）中的穗花杉雙黃酮含量最高，分別為4.46、4.40、3.15 mg/g；卷柏[S.tamariscina（Beauv.）Spring]、單籽卷柏（S.monspors Spring）和粗葉卷柏（S.trachyphylla A Br）次之，分別為2.79、2.51、2.15 mg/g；深綠卷柏（S.doederileinii Hieron）、黑頂卷柏（S.picata A Br.）、簿葉卷柏[S.delicatula（Desv.）Alston]和翠云草[S.uncinata（Desv.）Spring]中含量則分別只有1.47、1.08、0.56、0.36 mg/g。

1.2 穗花杉雙黃酮的制備工藝 有機溶劑浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法是穗花杉雙黃酮主要的制備方法（表1）。這些方法各有利弊，有機溶劑提取法操作、設備簡單，但存在耗時長，廢液易燃易爆、污染環(huán)境等問題[8-9]；微波輔助提取法[11]和超聲波輔助提取法[12]是利用微波和超聲波加快植物中有效物質(zhì)溢出，可提高提取效率，減少溶劑消耗，但能耗大、成本高，微波產(chǎn)生的高溫和超聲波還容易破壞穗花杉雙黃酮的多酚結(jié)構，難以應用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；超臨界流體萃取法[13]工藝流程短，提取效率高，綠色環(huán)保，但對提取壓力、溫度要求較高，設備昂貴，成本高。

表1 穗花杉雙黃酮的提取方法

2 穗花杉雙黃酮的生理功能及潛在作用機制

2.1 抗氧化和抗炎 正常情況下，機體NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxy Gen Species，ROS）等自由基可在抗氧化酶的作用下，通過氧化還原作用將自由基維持在正常水平范圍內(nèi)，但是在機體遭受疾病或外源異物的刺激時，自由基迅速增加會引起機體氧化應激，影響炎癥信號通路，促進炎癥反應[14-16]。穗花杉雙黃酮能夠上調(diào)機體抗氧化酶活性，具有極強清除ROS 的能力，已受到各界學者的廣泛關注[17-19]。體外研究表明，穗花杉雙黃酮可能通過提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化氫酶（CAT）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性[20]，抑制超氧陰離子O2·-的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物丙二醛（Malondiadehyde，MDA）水平來降低ROS 的生成[21]。

此外，穗花杉雙黃酮還可通過抑制核因子-кB（NF-кB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，其潛在作用機理見圖2[18-26]。外界刺激因子（如LPS）通過激活Toll 樣受體（TLRs）等膜受體，進而活化炎癥信號通路，導致機體氧化應激和炎癥損傷。誘導性一氧化氮合成酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）的過量表達所產(chǎn)生的大量一氧化氮（Nitric Oxide，NO）以及環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）的典型合成產(chǎn)物之一的前列腺素E2（Prostaglandin，PGE2）均可誘發(fā)氧化應激和炎癥反應。體外研究表明，穗花杉雙黃酮可抑制TLR4 的受體，介導iNOS、COX-2 表達量，進而抑制NO、PGE2、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等促炎因子的產(chǎn)生[22,24-25]。其潛在作用機理是穗花杉雙黃酮可通過抑制NF-κB 抑制因子IκB 的磷酸化和降解，阻斷NF-кB 亞基p65 和p50 的激活與核易位，抑制iNOS 的表達和NO 的產(chǎn)生[23]。此外，穗花杉雙黃酮可抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinases，ERK）、下游激活蛋白-1（Activator Protein 1，AP-1）的活性，阻斷ERK 信號通路，抑制PGE2和ROS 生成[22,26]。以上研究結(jié)果提示，穗花杉雙黃酮抗氧化和抗炎的潛在作用機制主要是通過抑制IκB 介導的NF-κB 信號通路以及ERK 信號通路。

圖2 穗花杉雙黃酮抗氧化及抗炎的潛在作用機理

2.2 抑菌 細菌的細胞壁和細胞膜保持完整是維持細菌正常代謝的基本前提，線粒體是細胞凋亡過程中的調(diào)控中心，當線粒體受到凋亡信號分子調(diào)控或膜結(jié)構遭到破壞時，細胞色素C 等促凋亡因子會釋放出來，加速細菌凋亡[27-28]。穗花杉雙黃酮可通過改變菌體細胞膜結(jié)構和通透性，誘導多種促凋亡因子生成，抑制毒性物質(zhì)產(chǎn)生，從而抑制豬鏈球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的生長（表2）。研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可通過破壞豬鏈球菌溶血素的分子構象，降低其寡聚物的形成，進而有效抑制豬鏈球菌溶血素的溶血活性，降低二型豬鏈球菌的活性[29]。穗花杉雙黃酮還可破壞金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細胞膜結(jié)構，促進細胞必需離子K+流失和胞外ATP 的釋放，誘導細菌死亡[30]。此外，穗花杉雙黃酮可使白色念球菌細胞的線粒體膜電位去極化，改變其結(jié)構和通透性，導致細胞色素C 進入細胞質(zhì)，誘導細胞內(nèi)羥基自由基-OH 增加，使ROS 增多，激活Caspases，誘導白色念球菌細胞凋亡[35]。由此可見，穗花杉雙黃酮具有廣譜抑菌作用，這可能與其對細菌膜通透性的影響有關，具體的分子機制還有待進一步研究。

表2 穗花杉雙黃酮抑菌效果

2.3 其他生理功能 穗花杉雙黃酮還具有抗癌、抗病毒、保護神經(jīng)、降血糖等多種生理功能。研究表明，穗花杉雙黃酮通過調(diào)控多種癌細胞凋亡因子，對多種癌細胞有顯著抑制作用[36-41]。Lee 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮能通過抑制脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS）的mRNA 水平和蛋白質(zhì)的表達，從而抑制乳腺癌細胞生長并誘導其凋亡。Wang 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，用穗花杉雙黃酮可顯著提高膠質(zhì)瘤細胞miR-124-3p 基因的表達量，促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。Tsai 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可顯著抑制肝癌細胞ERK/AKT 磷酸化、抗凋亡蛋白（MCL-1、C-FLIP、XIAP）的表達和腫瘤細胞生長，并協(xié)同抗癌藥物索拉非尼誘導癌細胞凋亡。此外，穗花杉雙黃酮能顯著抑制機體感染單純皰疹病毒一型（Herpes simplex virus-1，HSV-1）和其抗阿昔洛韋病毒株[45-46]。Chen 等[47]用小鼠進行Morris 水迷宮實驗研究穗花杉雙黃酮對神經(jīng)認知功能的影響，發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能極顯著抑制β-淀粉樣蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）對小鼠神經(jīng)功能的破壞，并通過AMPK 信號激活Nrf2 抗氧化通路，抑制Aβ1-42 神經(jīng)毒性的誘導，進而抑制阿爾茨海默癥的發(fā)生。Su 等[48]和Ighodaro 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可顯著降低動物體內(nèi)血糖水平、總膽固醇水平、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）以及胰高血糖素水平，提升高密度脂蛋白膽固醇（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）和胰島素水平，同時增加葡萄糖激酶（Glucokinase regulatory，GCK）、磷酸果糖激酶-1（Phosphofructokinase-1，PFK-1）和丙酮酸的活性，促進糖降解。以上研究提示，穗花杉雙黃酮對動物免疫及糖脂代謝具有一定的改善作用。

3 穗花杉雙黃酮在畜禽生產(chǎn)中的應用前景

仔豬斷奶引起的斷奶應激、高溫造成的熱應激以及集約化生產(chǎn)下飼養(yǎng)密度過高均會導致機體氧化還原系統(tǒng)失衡，誘發(fā)機體氧化應激，導致采食量下降、免疫力降低和生長發(fā)育受阻等一系列問題，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[50-51]。研究表明，豬應激時，體內(nèi)的SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活性明顯受到抑制，過量的ROS無法得到及時清除，加劇機體氧化應激和損傷[53-54]。穗花杉雙黃酮能直接清除體內(nèi)ROS，激活抗氧化酶信號通路，提高多種抗氧化酶活性，從而提高機體抗氧化能力，具有緩解畜禽生產(chǎn)氧化應激的潛力。

此外，畜禽養(yǎng)殖過程中易被病原菌感染而誘發(fā)多種疾病，如大腸桿菌引起的仔豬腹瀉[55-56]，致病性沙門氏菌引起的雞白痢、副傷寒[57]，金黃色葡萄球菌造成的奶牛乳房炎[58-59]等，嚴重阻礙畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展及經(jīng)濟效益。穗花杉雙黃酮可通過破壞多種致病菌細胞壁和細胞膜結(jié)構與通透性，抑制細菌生長或誘導其死亡，具有改善動物機體免疫和抗病能力，提高畜禽生產(chǎn)性能的潛在功效。

4 小 結(jié)

綜上所述，穗花杉雙黃酮具有抗炎、抗氧化和抑菌等生理功能，在緩解動物應激、減少炎癥損傷、提高動物抵抗致病菌的能力等方面具有巨大潛力，且其來源廣泛，具有作為天然飼料添加劑的應用前景。然而目前有關穗花杉雙黃酮的報道多見于小鼠等模型動物上，在畜禽生產(chǎn)上的應用鮮有報道，且其藥理、毒理作用尚未明確。筆者認為，今后的研究應關注穗花杉雙黃酮的藥理作用及安全性評價，包括穗花杉雙黃酮與腸道微生物的調(diào)控機制以及在不同畜禽動物飼糧中最佳添加比例和作用機制均有待進一步探究，為穗花杉雙黃酮作為新型綠色飼料添加劑提供強有力的理論依據(jù)。