沉默MMP-9對(duì)喉癌細(xì)胞侵襲、遷移及PI3K/Akt磷酸化水平的影響

左文娜，朱虹，金愛(ài)燕，王強(qiáng)，王洪琴

喉癌是喉黏膜上皮組織的惡性腫瘤，是頭部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。臨床主要表現(xiàn)為聲音嘶啞，咽喉異物感，咽下疼痛，痰中帶血，伴有刺激性咳嗽，病情嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致呼吸困難等[1]。該病多發(fā)于老年男性，中國(guó)喉癌的發(fā)病率約為5.83/10萬(wàn)，占全身腫瘤的2%左右[2]。隨著環(huán)境污染的加重，喉癌的發(fā)病率逐漸升高。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般與吸煙、口腔衛(wèi)生欠佳、接觸有害粉塵、內(nèi)分泌失調(diào)、病毒和維生素D代謝失常關(guān)系密切[3]。喉癌的發(fā)生不限于侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和血管生成，而且還與細(xì)胞外環(huán)境密切相關(guān)[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在細(xì)胞外基質(zhì)膜蛋白裂解和重構(gòu)中發(fā)揮著非常重要的作用，與癌癥的病理學(xué)特性廣泛相關(guān)[5]。相關(guān)研究表明，MMP-9在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成中起著重要的作用，并且介導(dǎo)腫瘤的微環(huán)境變化，在大多數(shù)情況下促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[6]。另外，MMP-9還與心血管疾病和免疫疾病相關(guān)。磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和凋亡等[7]。目前關(guān)于沉默MMP-9調(diào)控PI3K/Akt磷酸化水平的機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)觀察沉默MMP-9對(duì)喉癌細(xì)胞侵襲、遷移及PI3K/Akt磷酸化水平的影響，為臨床喉癌治療提供一定的參考，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 (1)實(shí)驗(yàn)對(duì)象：收集2018年3月—2019年3月河北省滄州市中心醫(yī)院耳鼻喉科診治喉癌患者20例的術(shù)后癌組織和癌旁組織(于-80℃冰箱中保存)。人鼻咽永生化上皮細(xì)胞：NP69、HEp2、TU212 、TU686、TU177細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。(2)試劑：甲醛、含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(南通碧云天生物技術(shù)研究所)；四甲基偶氮唑鹽(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Trizol裂解液、蛋白裂解液(南京建成生物工程研究所)；qRT-PCR試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。(3)儀器設(shè)備：酶標(biāo)儀(德國(guó)biosys bioreader)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀)、Transwell小室(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司 ，3422)、圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus 7.0)、顯微鏡(日本Olympus公司，CX23)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取NP69、HEp2、TU212、TU686、TU177細(xì)胞分別維持在DMEM與10%FBS的培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，2 d更換液體1次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用適量胰酶消化，吸出培養(yǎng)液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待后期實(shí)驗(yàn)備用。待HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%以上，取之進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染siRNA Control 40 nmol/L為siRNA Control組，轉(zhuǎn)染pGV 102-MMP-9-siRNA 40 nmol/L為MMP-9 siRNA組，按Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，只進(jìn)行換液處理，沒(méi)有轉(zhuǎn)染的HEp2細(xì)胞記為Control組。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)MMP-9 mRNA表達(dá)：將喉癌組織和癌旁組織放入液氮中研磨，在喉癌組織、癌旁組織呈粉狀時(shí)加入Trizol裂解液1 ml，提取組織中的RNA，并檢測(cè)純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)MMP-9 mRNA水平。為了驗(yàn)證MMP-9 mRNA在NP69、HEp2、TU212、TU686、TU177細(xì)胞的表達(dá)，也分別加入Trizol裂解液1 ml，提取細(xì)胞中的RNA，檢測(cè)純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，MMP-9 mRNA引物：上游5'-ACTTCATCACCATTCCAT-3',下游5'-GCTTCTTATCAACACT-3'；GAPDH內(nèi)參，上游5'-CAATTCTCCATTCTCATT-3',下游5'-CATATCCTATAATCCA-3',反應(yīng)條件為92℃、30 min， 80℃退火10 s，70 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)含量。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)HEp2細(xì)胞增殖： 將Control組、siRNA Control組和MMP-9 siRNA組轉(zhuǎn)染后的HEp2細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔接種到24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，在24 h、48 h、72 h、96 h，采用 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)儀在490 nm下完成吸光度值(OD)測(cè)定。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEp2細(xì)胞凋亡：取各組轉(zhuǎn)染后的HEp2細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)/孔接種于24孔板中，將熒光標(biāo)記的 Annexin V加到細(xì)胞懸液中，常溫孵育20 min，采用PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEp2細(xì)胞侵襲：將各組轉(zhuǎn)染后的HEp2細(xì)胞，以2 ×104個(gè)/孔接種無(wú)血清培養(yǎng)基的Transwell小室中進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，再將含10% FBS 的培養(yǎng)基放入Transwell小室中，孵育48 h后，使用甲醛固定，采用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲的數(shù)量。

1.3.5 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEp2細(xì)胞遷移：將各組轉(zhuǎn)染后的HEp2細(xì)胞以1 ×105個(gè)/孔放入6孔板中，室溫孵育12 h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)到80%時(shí)，采用200 μl移液槍頭刮細(xì)胞表面，使其形成傷口，顯微鏡拍照，使用Image J圖像處理軟件計(jì)算遷移面積，傷口愈合率=[(0 h面積-48 h面積) /0 h 面積]×100%。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法分析檢測(cè)PI3K/Akt磷酸化水平：取各組轉(zhuǎn)染后的HEp2細(xì)胞，加入蛋白裂解液，并收集裂解后的液體離心處理，取上清液，采用BCA法定量，提取總蛋白，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，再加入5%胎牛血清蛋白封閉60 min，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育12 h，洗膜后加入二抗，室溫孵育60 min后，TBST洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)p-PI3K、p-Akt、PI3K和Akt蛋白水平，拍照后應(yīng)用Gel-Pro analyzer軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-9在喉癌組織、癌旁組織和人鼻咽永生化上皮細(xì)胞中的表達(dá)比較 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，喉癌組織中MMP-9 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織(1.56±0.41 vs. 0.24±0.07,t/P=11.237/0.001)；鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69與HEp2、TU212、TU686、TU717細(xì)胞中MMP-9 mRNA表達(dá)水平分別為0.32±0.05、1.83±0.46、1.36±0.27、1.33±0.25、1.51±0.32，與鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69比較，HEp2、TU212、TU686、TU177細(xì)胞中MMP-9 mRNA表達(dá)明顯升高(t/P=8.673/0.009、6.431/0.017、6.159/0.022、6.873/0.011)，且HEp2細(xì)胞中MMP-9 mRNA表達(dá)最高，故后續(xù)采用HEp2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 沉默MMP-9對(duì)喉癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，Control組24 h、48 h、72 h和96 h的HEp2細(xì)胞增殖能力分別為0.26±0.05、0.48±0.07、0.83±0.09、1.26±0.13，siRNA Control組24 h、48 h、72 h和96 h的HEp2細(xì)胞增殖能力分別為0.24±0.06、0.46±0.06、0.82±0.07、1.19±0.11，MMP-9 siRNA Control組24 h、48 h、72 h和96 h的HEp2細(xì)胞增殖能力分別為0.24±0.07、0.44±0.08、0.51±0.06、0.69±0.07。與Control組比較，siRNA Control組各時(shí)點(diǎn)HEp2細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=0.795/0.274、0.831/0.213、 0.949/0.195、0.982/0.154)；與siRNA Control組比較，MMP-9 siRNA組24 h、48 h細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=1.036 /0.116、1.227/0.109),而72 h和96 h細(xì)胞增殖能力顯著降低(t/P=5.382/0.005、5.146/0.007)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，siRNA Control組HEp2細(xì)胞凋亡能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=1.156/0.785); MMP-9 siRNA組HEp2細(xì)胞凋亡能力明顯高于Control組和siRNA Control組(t/P=8.643/0.001、8.237/0.001)，見(jiàn)圖1。

注：與Control組比較，aP<0.01

2.3 沉默MMP-9對(duì)喉癌細(xì)胞侵襲作用的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，siRNA Control組HEp2細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=1.379/0.483)； MMP-9 siRNA組HEp2細(xì)胞侵襲能力顯著低于Control組和siRNA Control組(t/P=7.673/0.001、6.792/0.002)，見(jiàn)圖2。

注：與Control組比較，aP<0.01

2.4 沉默MMP-9對(duì)喉癌細(xì)胞遷移作用的影響 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，siRNA Control組HEp2細(xì)胞愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=1.756/0.336)； MMP-9 siRNA組HEp2細(xì)胞愈合度顯著低于Control組和siRNA Control組(t/P=6.882/0.003、6.513/0.005)，見(jiàn)圖3。

注：與Control組比較，aP<0.01

2.5 沉默MMP-9對(duì)PI3K/Akt蛋白磷酸化水平的影響 Western-blot分析檢測(cè)結(jié)果顯示， Control組、siRNA Control組和MMP-9 siRNA組中PI3K、Akt蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Control組、siRNA Control組中p-PI3K和p-Akt蛋白水平比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MMP-9 siRNA組中p-PI3K和p-Akt蛋白水平顯著低于Control組和siRNA Control組(t/P=9.459/0.001、8.736/0.001、6.873/0.001、6.694/0.001)，見(jiàn)圖4。

注：與Control組比較，aP<0.01

3 討 論

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，以喉鱗癌為主要類(lèi)型，近年來(lái)，喉癌的發(fā)病率逐漸增高。全切除術(shù)是一種傳統(tǒng)的喉癌治療方法，可顯著減少該病的復(fù)發(fā)情況，但可能引起喉部功能喪失[8]。放化療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于喉癌的治療，盡管可以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但總體的治療效果并不理想，預(yù)后不良，生存率低，后遺癥和并發(fā)癥較多，嚴(yán)重影響了患者的生命及生活質(zhì)量[9]。所以亟需深入了解喉癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療策略提高喉癌的診治和預(yù)后水平。

腫瘤細(xì)胞穿透基底膜的過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)發(fā)揮著重要的作用，它能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)從而形成腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的通道[10]。MMP-9與腫瘤的關(guān)系尤其密切，MMP-9基因位于染色體20q13.12，MMP-9蛋白含有催化結(jié)構(gòu)域、血凝素樣結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽和前肽結(jié)構(gòu)[11-12]。MMP-9具有蛋白水解裂解活性，在細(xì)胞外環(huán)境中參與許多生物學(xué)過(guò)程，促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13]。MMP-9在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中也起到重要的作用，相關(guān)研究表明，miR-188-5p通過(guò)MMP-9表達(dá)而抑制瘢痕疙瘩的增殖和侵襲[14]。本研究通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)MMP-9在喉癌組織和喉癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)喉癌組織中MMP-9 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織，與鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69比較，HEp2、TU212、TU686、TU177細(xì)胞中MMP-9 mRNA表達(dá)明顯升高，證明了MMP-9在喉癌組織和喉癌細(xì)胞中高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。

本結(jié)果表明，沉默MMP-9的HEp2細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯降低，細(xì)胞愈合度也明顯減少，從而說(shuō)明抑制MMP-9能夠抑制HEp2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究表明，沉默MMP-9能夠抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲[15]，與本結(jié)論相類(lèi)似。MMP-9能夠降解血管基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，從而參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，同時(shí)能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤血管的發(fā)生，因此沉默MMP-9可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，從而抑制腫瘤血管的發(fā)生。

PI3K是具有催化活性的信號(hào)蛋白，與下游的AkT結(jié)合發(fā)生磷酸化，構(gòu)成PI3K/Akt信號(hào)通路，該通路在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MMPs表達(dá)呈PI3K依賴的特點(diǎn)，即激活PI3K會(huì)使MMPs的表達(dá)水平上調(diào)，抑制PI3K會(huì)使MMPs的表達(dá)水平下調(diào)[18]。本結(jié)果顯示，沉默MMP-9 的表達(dá)，p-PI3K和p-Akt蛋白水平明顯低于Control組和siRNA Control組。由此推測(cè)，沉默MMP-9可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解，來(lái)減緩喉癌的發(fā)展。

綜上所述，沉默MMP-9對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響，并闡述了與PI3K/Akt蛋白磷酸化水平的關(guān)系，為喉癌的診斷和治療研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

左文娜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；朱虹：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;金愛(ài)燕：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;王強(qiáng)：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改;王洪琴：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)