蜂蜜中揮發(fā)性化合物萃取分析技術(shù)的研究進(jìn)展

劉歡，李亮

1. 上海工微所科技有限公司（上海 200233）；2. 上海冠生園蜂制品有限公司（上海 201419）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜氣味香甜、口感潤滑并且具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。蜂蜜風(fēng)味能夠直觀地反映出蜂蜜的品質(zhì)特性，而其特有風(fēng)味的形成依賴于多種揮發(fā)性化合物的協(xié)同作用，尤其是一些氣味閾值較低的化合物。目前蜂蜜中揮發(fā)性化合物的研究方法已較為成熟。揮發(fā)性化合物被從蜂蜜中萃取出來后，通常運(yùn)用配有檢測(cè)器的氣相色譜儀（Gas chromatography，GC）進(jìn)行化合物的分離鑒定，或者運(yùn)用感官分析對(duì)蜂蜜風(fēng)味進(jìn)行具體描述[2]。萃取分析直接影響蜂蜜中揮發(fā)性成分的提取效率和鑒定結(jié)果，是后續(xù)進(jìn)行蜂蜜分析和評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。主要從萃取分析技術(shù)等方面綜述近年來蜂蜜中揮發(fā)性化合物的研究成果，旨在為蜂蜜揮發(fā)性化合物的研究提供理論參考。

1 萃取技術(shù)

溶劑萃取和頂空萃取是分析揮發(fā)性化合物常用的萃取技術(shù)。溶劑萃取使用有機(jī)溶劑萃取蜂蜜中的揮發(fā)性成分，操作繁瑣且容易造成環(huán)境污染。頂空萃取則避免了有機(jī)溶劑的使用。

1.1 溶劑萃取

液液萃?。↙iquid-liquid extraction，LLE）是最基本的溶劑萃取技術(shù)，非極性或弱極性的二氯甲烷[2]和乙醚[3]等有機(jī)溶劑通常用來萃取蜂蜜中的揮發(fā)性化合物。同時(shí)蒸餾萃?。⊿imultaneous steam distillation-solvent extraction，SDE）和超聲波輔助萃?。║ltrasoundassisted extraction，USE）則是在LLE的基礎(chǔ)上分別結(jié)合水蒸餾法和超聲波法，以提高萃取效率。王興龍等[4]分別利用LLE、SDE和USE方法萃取油菜蜜中揮發(fā)性成分。結(jié)果顯示，LLE結(jié)果中的化合物數(shù)量最少（28種），SDE和USE則分別有36種和48種。但是，這3種方法對(duì)樣品的多次重復(fù)萃取，造成有機(jī)溶劑使用量的增加[3,5]。固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）可以集樣品凈化和富集于一體，首先使用預(yù)處理后的萃取柱吸附蜂蜜中的目標(biāo)化合物，然后使用少量的有機(jī)溶劑洗脫。萃取柱中填充的吸附材料種類多樣，梁芳慧等[3]對(duì)比分析了HLB柱、LC-C18柱和LC-C4柱對(duì)蜂蜜中揮發(fā)性成分的萃取效果。結(jié)果顯示，親水性HLB柱萃取到47種化合物，基本涵蓋了LC-C18柱和LC-C4柱萃取的化合物。Jasicka-Misiak等[6]在分析菊科蜜時(shí)使用的是SDBL柱；Uckun等[2]分析柑橘和黃芪蜜時(shí)使用的是OASIS柱。

1.2 頂空萃取

頂空萃取是分析揮發(fā)性化合物常用的方法，在密閉的容器中，一定溫度下化合物從蜂蜜中揮發(fā)出來后被捕集裝置捕獲。捕集裝置可以是氣體針、填充或涂覆有吸附材料的吸附管、不銹鋼絲或者攪拌棒等。靜態(tài)頂空（Static headspace extraction，SHS）是利用氣體進(jìn)樣針抽取蜂蜜上方氣體并直接進(jìn)樣到GC中的技術(shù)。Arroyo-Manzanares等[7]鑒定蜂蜜摻假時(shí)，稱取1 g蜂蜜放入20 mL頂空瓶并最終抽取750 μL氣體進(jìn)行檢測(cè)。王文靜等[8]判別蜂蜜蜜源時(shí)，稱取13 g蜂蜜并且進(jìn)樣體積為1 mL。動(dòng)態(tài)頂空（Dynamic headspace extraction，DHS）又叫吹掃捕集，其利用大流量高純氣體吹掃蜂蜜上方氣體，同時(shí)填充有多孔聚合物的吸附管（通常為Tenax TA）選擇性地吸附揮發(fā)性化合物[9]。Escriche等[10]運(yùn)用DHS分析薰衣草蜜和百里香蜜時(shí)，使用100 mL/min的氮?dú)獯祾邩悠凡⑹褂肨enax TA吸附管捕集揮發(fā)性成分。Patrignani等[11]則使用30 mL/min的氦氣吹掃阿根廷蜂蜜。

固相微萃?。⊿olid-phase microextraction，SPME）是將涂覆有吸附材料的探針插入樣品上方氣相，一定時(shí)長的萃取過后，將探針拔出并直接插入GC進(jìn)樣口脫附的技術(shù)。SPME在蜂蜜揮發(fā)性成分的研究中被廣泛應(yīng)用。Karabagias等[12]對(duì)不同產(chǎn)地柑橘蜜的SPME分析中，萃取條件分別為探針涂層DVB/CAR/PDMS（Divinylbenzene/Carboxen/polydimethylsiloxane）、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間30 min、平衡時(shí)間15 min、樣品量2 g和氯化鈉0.2 g。結(jié)果共檢測(cè)出33種化合物，其中總揮發(fā)物含量順序?yàn)槟β甯纾鞠ＥD＞埃及＞西班牙。王桃紅等[13]運(yùn)用SPME分析了60 ℃時(shí)14個(gè)成熟度不同（波美度35.6-42.0）的蕎麥蜜。結(jié)果共檢測(cè)出168種揮發(fā)性化合物，其中酯類和醇類在成熟度低的蕎麥蜜中含量較高，而醛類和酸類含量在成熟度高的蕎麥蜜中較高。此外，棗花蜜、刺槐蜜以及百花蜜等多種類蜂蜜的SPME分析也都有報(bào)道[14-16]。作為SPME的一種衍生技術(shù)，Cacho等[17]使用涂覆了吸附材料的攪拌棒對(duì)蜂蜜中的單萜類化合物進(jìn)行分析。在PDMS、聚丙烯酸酯和乙二醇-硅酮三種涂層中，PDMS對(duì)芳樟醇、香葉醇、薄荷醇和桉樹油的靈敏度最高。此外，在12個(gè)蜂蜜樣品中，化合物的最高檢測(cè)濃度達(dá)到64 ng/g。

2 分析技術(shù)

2.1 色譜分析

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC Mass spectrometry，GC-MS）是高效分析食品中揮發(fā)性化合物的儀器。在GC進(jìn)樣口迅速氣化的化合物隨載氣（高純氦氣）進(jìn)入色譜柱并被分離開，之后MS檢測(cè)器將其離子化并檢測(cè)定性。對(duì)于蜂蜜來說，已鑒定出的揮發(fā)性化合物在40種以上[18]。Pattamayutanon等[19]利用HS-SPMEGC-MS分析不同種類的泰國蜂蜜，結(jié)果共鑒定出63種揮發(fā)性化合物，其中有32種被認(rèn)為是潛在的蜜源標(biāo)記物。Karabagias等[20]利用HS-SPME-GC-MS分析了柑橘蜜、冷杉蜜、松樹蜜和百里香蜜四種蜜源共82個(gè)樣品，并進(jìn)行了多元方差分析。結(jié)果表明，蒔蘿醚、α-4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-乙醛、乙酸乙酯、辛酸乙酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、2, 2, 4, 6, 6-五甲基庚烷、苯乙醛、順式芳樟醇氧化物和丁香醛（異構(gòu)體Ⅲ）等9種化合物可以有效鑒定蜂蜜蜜源。王華堂等[21]還將指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于中意蜂荔枝蜜的HS-SPME-GCMS分析，通過比對(duì)各荔枝蜜的色譜圖數(shù)據(jù)，找到并建立了包含有16個(gè)共有峰的荔枝蜜揮發(fā)性成分的指紋圖譜。此外，他們還針對(duì)中意蜂龍眼蜜分別建立了包含16個(gè)和15個(gè)共有峰的龍眼蜜揮發(fā)性成分的指紋圖譜[22]。其他一些運(yùn)用HS-SPME結(jié)合GC-MS來研究蜂蜜中揮發(fā)性化合物的文獻(xiàn)匯總在表1中。在色譜分析中，化合物的有效分離是關(guān)鍵步驟，并且分離效果受到色譜柱種類的影響。蜂蜜中揮發(fā)性成分的分離通常采用非極性或弱極性的色譜柱（表1）。王桃紅等[13]分析蕎麥蜜時(shí)還對(duì)DB-5MS和VF-624的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，無論是化合物峰個(gè)數(shù)還是響應(yīng)值，DB-5MS均明顯優(yōu)于VF-624。

表1 蜂蜜中揮發(fā)性化合物的HS-SPME-GC-MS分析條件及研究內(nèi)容

全二維氣相色譜（GC×GC）是將兩臺(tái)配置了不同極性色譜柱的GC串聯(lián)，并且兩臺(tái)GC之間安裝有調(diào)制器，可以將第一根色譜柱分離后的化合物聚焦，接著傳入第二根色譜柱進(jìn)行分離。所有被分離組分最后進(jìn)入檢測(cè)器并最終得到以柱1保留時(shí)間為第一橫坐標(biāo)（min），柱2保留時(shí)間為第二橫坐標(biāo)（s），信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的三維色譜圖或二維輪廓圖，其中第二根色譜柱通常采用OV-1701、BPX50或各種環(huán)糊精作為固定相[40]。?pánik等[41]運(yùn)用GC×GC-FID研究了蜂蜜中10種手性揮發(fā)性化合物的對(duì)映體比率，并得出結(jié)論：反式-芳樟醇氧化物的對(duì)映體比例可以用作向日葵和栗子蜂蜜的標(biāo)記。該研究選用DB-FFAP作為第一根色譜柱，第二根色譜柱則根據(jù)化合物性質(zhì)分別選用過甲基-β-環(huán)糊精（順（反）式-芳樟醇氧化物、（脫氫）芳樟醇和4（α）-松油醇）和6-叔丁基二甲基甲硅烷基-2, 3-二甲基-β-環(huán)糊精（丁香醛A-D）。區(qū)別于MS檢測(cè)器的離子分離原理（質(zhì)荷比），離子遷移譜（Ion mobility spectroscopy，IMS）是根據(jù)離子的不同遷移時(shí)間來分離定性。HS-GC-IMS技術(shù)已被應(yīng)用于蜂蜜摻假鑒定，其中色譜柱為FS-SE-54-CB-0.5或者HP-5MS UI[7,42]。火焰離子化檢測(cè)器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID）使用氮?dú)庾鳛檩d氣，其通常與GC-MS結(jié)合使用并被用于蜂蜜揮發(fā)性成分研究中的條件優(yōu)化部分[43]。

2.2 感官分析

感官分析可以對(duì)食品的氣味、滋味等感官屬性進(jìn)行定性檢測(cè)和定量描述，其中描述性分析是食品感官分析領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的方法。Kru?ík等[44]在鑒別蜂蜜摻假的研究中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)可能摻假的蜂蜜樣品。感官分析結(jié)果表明，這些樣品具有非自然或類似糖的氣味，雖然它們整體風(fēng)味的評(píng)分還不錯(cuò)，但是令人愉悅度卻比較低。感官分析還常與色譜分析結(jié)合使用來探索蜂蜜香氣與化合物之間的關(guān)聯(lián)性。Costa等[45]運(yùn)用描述性分析和GC-MS對(duì)比了3種單花蜂蜜的風(fēng)味特征。結(jié)果顯示，juazeiro蜂蜜具有強(qiáng)烈的焦糖香氣，且苯甲醛和苯乙醛可能與其特征性的風(fēng)味有關(guān)系。Velame蜂蜜中酸類物質(zhì)含量較高且具有丁香香氣。對(duì)于juremabranca蜂蜜，其草本香氣的重要貢獻(xiàn)化合物則可能是己醇、檸檬烯、α-法呢烯和δ-卡丁烯。Siegmund等[40]運(yùn)用一種快速描述性分析方法（Napping）、GC-MS和GC×GC-MS對(duì)8種蜂蜜進(jìn)行對(duì)比和分類，并進(jìn)行了主成分分析。結(jié)果顯示揮發(fā)性化合物和感官評(píng)價(jià)的分析結(jié)果具有很高的關(guān)聯(lián)性，表明Napping非常適合對(duì)單種/單花蜂蜜進(jìn)行快速分類。

隨著科技的進(jìn)步，智能化的感官分析儀器不斷被研發(fā)出來并被用于食品分析。電子鼻是模擬人體嗅覺受體開發(fā)出來的分析揮發(fā)性氣味物質(zhì)的儀器。它可以獲得蜂蜜中揮發(fā)性化合物的整體信息，常被用來進(jìn)行蜂蜜種類的鑒別和分類[46]。嗅聞儀（Olfactometry，O）通過與色譜儀器的聯(lián)用，可以針對(duì)某一種揮發(fā)性成分進(jìn)行氣味描述，并進(jìn)一步確定影響蜂蜜香氣的關(guān)鍵性物質(zhì)[47]。如敖常偉等[14]分析棗花和棗花蜜香味化合物的研究中，GC-MS-O的檢測(cè)結(jié)果顯示棗花的主要香氣來源為具有植物果香味的酯類物質(zhì)，尤其是2-甲基丁酸乙酯。此外，17種共有成分是棗花蜜具有棗花香氣的主要原因。而在柑橘和黃芪蜂蜜中，苯乙醇是最有效的關(guān)鍵化合物并賦予蜂蜜花香氣味[2]。

3 結(jié)語與展望

蜂蜜的風(fēng)味特征是反映蜂蜜品質(zhì)的重要指標(biāo)，而特征性風(fēng)味的形成主要依賴于其中的揮發(fā)性化合物。因此蜂蜜中揮發(fā)性化合物的研究受到蜂蜜研究者及生產(chǎn)企業(yè)的關(guān)注。揮發(fā)性化合物的研究方法主要分為兩個(gè)部分：萃取分離和分析鑒定。頂空萃取有著溶劑萃取不可比擬的優(yōu)勢(shì)，例如避免有機(jī)溶劑的使用和不需要過多的樣品處理。色譜分析和感官分析的結(jié)合使用，有利于獲取更全面的蜂蜜風(fēng)味輪廓?？傮w來說，揮發(fā)性化合物的研究技術(shù)將不斷向著環(huán)保、快速、無損和高效的方向發(fā)展。目前，蜂蜜中揮發(fā)性成分的研究內(nèi)容多為蜜源的鑒定和區(qū)分、蜂蜜摻假的檢測(cè)以及潛在標(biāo)記物的鑒定等，而很少有蜂蜜成分的周期性變化分析。揮發(fā)性成分的組成不僅包括蜂蜜自身的香氣成分，還有生產(chǎn)儲(chǔ)藏過程中發(fā)生的理化或微生物反應(yīng)的產(chǎn)物。因此，蜂蜜中的揮發(fā)性成分可能成為蜂蜜品質(zhì)變化的潛在指標(biāo)。