綠原酸眼用溫敏型凝膠的制備及兔眼房水內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

李新南 景年水

濟(jì)南市第二人民醫(yī)院藥劑科 250001

綠原酸是中藥金銀花中的主要成分，是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，又稱為咖啡鞣酸，屬于苯丙素類化合物［1］。其具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用，在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［2-5］。金銀花因其清熱解毒，可治療風(fēng)火目赤，常用于治療暴發(fā)火眼、目赤腫痛、瘡癰腫毒等，臨床上廣泛用于治療單皰病毒角膜炎、沙眼、結(jié)膜炎等［6］。

傳統(tǒng)的滴眼液由于淚液分泌、眨眼反射、鼻淚管排出等造成藥物作用時(shí)間短，一般滴眼液具有超過(guò)70%的藥液損失，生物利用度低［7］。另外，大量的藥物可以經(jīng)鼻淚管進(jìn)入鼻腔或者消化道從而被全身吸收，勢(shì)必大大增加誘發(fā)各種不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。開(kāi)發(fā)以泊洛沙姆等高分子材料為基質(zhì)的新型眼用溫敏凝膠，以液態(tài)形式滴入眼部，在結(jié)膜囊內(nèi)形成凝膠呈半固體狀態(tài)，不僅可以解決普通滴眼液眼內(nèi)滯留時(shí)間短、生物利用度低的問(wèn)題，還可以克服普通眼用凝膠缺乏良好的鋪展性及計(jì)量不易控制等諸多問(wèn)題，具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景［8］。本實(shí)驗(yàn)于2020年1月至10月以泊洛沙姆為溫敏材料制備綠原酸溫敏凝膠，給藥后采用高效液相色譜法（HPLC）以及微透析技術(shù)測(cè)定不同時(shí)間綠原酸在眼房水中含量，比較綠原酸滴眼液與綠原酸溫敏凝膠在家兔眼內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。

1 材料與儀器

1.1 儀器 微滲析系統(tǒng)（微量泵控制器和MD-1001型微量注射泵，美國(guó)BAS 公司）；LM-10微滲析探針（美國(guó)BAS公司）；裂隙燈顯微鏡（日本尼德科公司）；Agilent1260 高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器）；SYC-15 超級(jí)恒溫水浴（南京桑力電子設(shè)備廠）；BS110S 電子分析天平（德國(guó)塞多利斯公司）；KQ-5200E型醫(yī)用超聲波清洗器（功江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B20782）；綠原酸，山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，純度97%；泊洛沙姆188（Pluronic F68，BASF 德國(guó)）；泊洛沙姆407（Pluronic F127，BASF 德國(guó)）；甲醇（色譜純，天津四友）；乙腈（色譜純，天津四友）；純凈水（哇哈哈，市售）；其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大耳白家兔［濟(jì)寧魯抗公司，動(dòng)物飼養(yǎng)合格證SCXK（魯）20130001］，雌雄各2 只，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，裂隙燈顯微鏡下檢查雙眼無(wú)疾病，單籠飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸眼用溫敏凝膠的制備 精密稱取綠原酸適量，溶于注射用水中，配成4%（mg/ml）溶液，加入20%的泊洛沙姆407 和1%的泊洛沙姆188，室溫?cái)嚢韬笾糜? ℃冷藏，完全溶解后，加入5% 的苯扎溴銨使其濃度為1/10 000，制得綠原酸眼用溫敏凝膠，混勻，濾過(guò)滅菌，分裝，即得。測(cè)定其pH 為7.01，相變溫度為26.9 ℃，人工淚液稀釋后膠凝溫度為33.8 ℃，所得凝膠為淡黃色、均勻，在儲(chǔ)存期為液態(tài)，滴入眼內(nèi)形成凝膠呈半固體狀態(tài)。

2.2 眼部藥代動(dòng)力學(xué)

2.2.1 房水藥物濃度HPLC分析方法的建立

2.2.1.1 色譜條件的選擇 Diamond C18色譜柱，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)318 nm，流速1.0 ml/min，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序（%）

2.2.1.2 方法專屬性考察 在上述色譜條件下，制備空白滲析液樣品，進(jìn)樣，得滲析液樣品色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由結(jié)果可以看出，在上述色譜條件下，空白滲析液對(duì)綠原酸測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 空白滲析液與給藥后透析液樣品（A為綠原酸透析液，B為空白透析液）

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取綠原酸適量，精密加入流動(dòng)相稀釋，制成每毫升溶液含綠原酸38.16μg，搖勻，即得綠原酸對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣3、6、9、12、15μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1.4 方法學(xué)考察 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性方法學(xué)考察符合規(guī)定。

2.2.2 植入探針與給藥 術(shù)前30 min 以及手術(shù)后4 h，于家兔耳緣靜脈注射100 U/kg 肝素鈉。家兔眼結(jié)膜下注射2%利多卡因表面麻醉，開(kāi)瞼器撐開(kāi)眼瞼，用5#針頭于角膜結(jié)膜緣前1 mm 處斜刺入眼前房室內(nèi)，LM-10微滲析探針沿針孔導(dǎo)入眼前房?jī)?nèi)，棄去針頭，調(diào)整滲透窗使其全部置于房水中，探針的兩端分別固定于鼻顳側(cè)和外眼角。窗口處給予一定抗生素滴眼液預(yù)防感染，恢復(fù)至傷口完全愈合后，微注射泵以1.0 μl/min 流速向探針內(nèi)灌裝0.9%氯化鈉注射液，平衡一定時(shí)間后開(kāi)始給藥。食指與拇指分開(kāi)家兔上下眼瞼，分別將50μl 綠原酸滴眼液、綠原酸溫敏凝膠滴在靠外側(cè)眼角白眼珠下方的結(jié)膜囊內(nèi)，將上眼瞼稍稍提起，讓藥液盡可能保留在結(jié)膜囊內(nèi)，然后輕輕閉合眼瞼片刻，以增加藥水與眼球接觸時(shí)間，防止藥物溢出，開(kāi)始收集滲析液。

2.2.3 濃差法探針體外回收率 分別配制3 個(gè)1.0、2.0、3.0 mg/ml 不同濃度的綠原酸樣品溶液，調(diào)整微滲析滲透窗的位置，保證其全部置于3 個(gè)不同濃度的樣品生理鹽水溶液中，分別調(diào)整微注射泵的流速為1、2、3μl/min，以氯化鈉注射液為灌注液，每次平衡0.5 h，收集滲析液，HPLC法測(cè)定滲析液中綠原酸的含量。計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2?；厥章剩≧）=Cd/Cin×100%，Cd 為滲析液藥物濃度，Cin 為已知藥物濃度。

表2 不同綠原酸濃度在不同微注射泵流速下的體外回收率（n=3，%）

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，綠原酸體外回收率均隨著灌注液的流速的增大而呈明顯的降低趨勢(shì)，分析原因可能是在低流速下，探針滲析膜內(nèi)外藥物有充足的時(shí)間進(jìn)行擴(kuò)散，從而使更多的組織藥物進(jìn)入滲析液內(nèi)，從而使相對(duì)回收率較高，并且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低流速的灌注液組得到的滲析液中藥物的濃度較高。灌注液高流速組由于缺少足夠的時(shí)間進(jìn)行平衡交換而造成回收率下降。但是，如果灌注速度太小，也會(huì)導(dǎo)致采集樣品的體積較小，造成采集時(shí)間延長(zhǎng)。因此，綜合考慮，選擇2.0μl/min作為灌注液流速。

2.2.4 反向滲析法測(cè)定在體探針回收率 家兔眼表面丁卡因麻醉后，植入探針至前房?jī)?nèi)，經(jīng)過(guò)一定恢復(fù)期后，觀察傷口完全愈合。分別配制0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml濃度的樣品溶液。灌注液流速設(shè)定為2.0μl/min，以不同濃度樣品生理鹽水溶液進(jìn)行灌注。每次更換灌注液后沖洗30 min，每一樣品采集15 min，平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表3、圖3。相對(duì)回收率（R）=Cd-Cp/Cm-Cp，其中Cd為滲析液中藥物濃度，Cm為組織液中藥物濃度，Cp為灌注液中的藥物濃度，以Cd-Cp 對(duì)Cp 作圖。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以（Cd-Cp）對(duì)Cp 分別作圖，得到線性方程Cd-Cp=-0.436 2 Cp+0.006 6，計(jì)算的回收率為（43.62±2.55）%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，綠原酸在體回收率均低于體外回收率，可能與滲透膜表面的少量纖維化以及房水中大分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸附、沉聚于膜表面從而阻礙藥物擴(kuò)散造成。

表3 反向滲析法測(cè)定綠原酸濃度

圖3 反向滲析法測(cè)定綠原酸在體探針回收率

2.2.5 綠原酸制劑眼內(nèi)藥動(dòng)學(xué)測(cè)定 設(shè)定流速2.0μl/min的生理氯化鈉為灌注液，沖洗30 min 后，分別將50μl 綠原酸滴眼液、眼用綠原酸溫敏凝膠滴在靠外側(cè)眼角白眼珠下方的結(jié)膜囊內(nèi)，將上眼瞼稍稍提起，讓藥液盡可能保留在結(jié)膜囊內(nèi)，然后輕輕閉合眼瞼片刻，以增加藥水與眼球接觸時(shí)間，防止藥物溢出，開(kāi)始收集滲析液，在最開(kāi)始的1 h 內(nèi)，每隔15 min 取樣1 次，然后30 min 取樣1 次，共測(cè)定6 h。HPLC法測(cè)定滲析液中綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表4、圖4。

表4 不用藥物家兔局部給藥后的房水藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=4）

圖4 家兔眼部房水中綠原酸濃度-時(shí)間曲線（n=4）

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)綠原酸滴眼液作用于家兔眼部表明時(shí)，綠原酸立即透過(guò)角膜，作用較為迅速，但是由于藥液的迅速流失，作用時(shí)間短，生物利用度低，并且眼睛具有流淚和眨眼反射等非常有效的保護(hù)機(jī)制，一般滴眼液具有超過(guò)70%的藥液損失。滴眼液中綠原酸的藥物濃度在0.5 h達(dá)峰，峰濃度為（2.390±0.427）μg/ml，然后逐漸降低，藥時(shí)曲線下面積分別為（2.257±0.516）μg/（h·ml），當(dāng)眼用綠原酸溫敏凝膠作用于家兔眼部表面時(shí)，綠原酸的藥物-時(shí)間AUC顯著增大，綠原酸的Cmax 為（4.370±0.942）μg/ml，生物利用度為綠原酸滴眼液中的3.175倍，顯著提高了綠原酸制劑中有效成分的生物利用度，并且Tmax 均有所延長(zhǎng)。間接說(shuō)明凝膠基質(zhì)中對(duì)藥物的釋放具有阻滯作用，從而使藥物可以持續(xù)釋放并透過(guò)角膜進(jìn)入房水，延緩了房水中藥物濃度的降低。

3 討 論

目前常用的眼內(nèi)組織液的取樣方法為穿刺取樣法，通常為給藥后在不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，對(duì)房水或玻璃體進(jìn)行一次取樣，動(dòng)物個(gè)體差異性較大，并且單次取樣所得的樣品集合是非連續(xù)性的。微透析技術(shù)能夠在同一組織內(nèi)連續(xù)不間斷的取樣，并且可以進(jìn)行藥物的動(dòng)態(tài)監(jiān)不但可以減少動(dòng)物數(shù)量，還能減少誤差，對(duì)組織損傷較小，可以排除麻醉劑和蛋白結(jié)合對(duì)藥物測(cè)定的干擾，為眼部藥物動(dòng)力學(xué)的研究提供了新的手段［9-10］。本部分首先建立了HPLC 測(cè)定綠原酸含量的方法，利用濃差法測(cè)定探針體外回收率，反向滲析法測(cè)定在體探針回收率，建立了眼局部給藥后在體測(cè)定藥動(dòng)學(xué)參數(shù)模型，降低了實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)現(xiàn)了在體連續(xù)取樣。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在體回收率明顯低于體外回收率，分析原因可能是由于探針植入后，造成局部的輕微損傷，從而在滲析窗表面形成纖維，從而使回收率降低。并且微透析技術(shù)也有不足之處，如樣品采集量較小，有時(shí)候?qū)Ψ治鼋Y(jié)果有較大影響，植入眼部過(guò)程中稍有不慎便會(huì)造成眼部較為明顯損傷，從而導(dǎo)致滲出明顯等問(wèn)題。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，眼部分別滴入綠原酸滴眼液和眼用綠原酸溫敏凝膠滴眼液后，兩者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有較大差異。綠原酸凝膠組的綠原酸的AUC 為綠原酸滴眼液的3.0 倍，且Cmax 和Tmax 均有明顯增大，分析可能是溫敏凝膠采用泊洛沙姆作為凝膠基質(zhì)，提高了制劑的凝膠粘度和強(qiáng)度，增大了滴眼劑的黏滯度，可使藥物在眼內(nèi)停留時(shí)間延長(zhǎng)，增加藥物與角膜的接觸時(shí)間，有效減少藥物角膜前流失。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。