藍(lán)莓多酚在發(fā)酵酸奶貯藏期穩(wěn)定性研究

許尨 *，高鵬，馬海然 ，李洪亮

1. 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司（呼和浩特 011500）；2. 蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司（北京 101100）；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品與奶牛繁育生物工程技術(shù)企業(yè)重點實驗室（呼和浩特 011500）

隨著消費者對于健康安全飲食的關(guān)注和認(rèn)知的提升，關(guān)于酸奶單獨的營養(yǎng)價值和生理功效研究逐漸增多，同時富含多酚類的果蔬植物也開始進(jìn)入消費者視野，針對植物資源的功能性研究逐漸熱門，抗氧化的評價、促進(jìn)胃腸道健康、消化吸收、提高生理功能及一定保健作用成為營養(yǎng)學(xué)研究熱點[1]。

藍(lán)莓為杜鵑花科越橘屬多年生低灌木，原產(chǎn)地為北美洲與東亞地區(qū)。果實中含有豐富的營養(yǎng)成分，主要以花青素等多酚類物質(zhì)為主，它不僅具有良好的營養(yǎng)保健作用，還具有防止腦神經(jīng)老化、強心、抗癌、軟化血管、增強人體免疫、抗衰老、抑制有害菌等功能[2]。藍(lán)莓因具有較強的抗氧化活性及在產(chǎn)品中的應(yīng)用，不斷被中國消費者認(rèn)可接納，伴隨功能性食品開發(fā)流行趨勢，將藍(lán)莓與酸奶、牛奶等進(jìn)行組合開發(fā)復(fù)合乳制品，提高乳產(chǎn)品的綜合功能性和營養(yǎng)價值。但針對藍(lán)莓酸奶產(chǎn)品的主要研究集中在產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、產(chǎn)品開發(fā)工藝設(shè)計優(yōu)化等方面，對于藍(lán)莓酸奶中含有的多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性及共存營養(yǎng)組分對產(chǎn)品抗氧化能力和吸收利用的研究較少。多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性受產(chǎn)品儲存溫度、產(chǎn)品最終pH、獨立產(chǎn)品包裝的內(nèi)部含氧量，以及產(chǎn)品體系中穩(wěn)定劑種類和蛋白、脂肪組分含量的影響，多酚類物質(zhì)在貯藏期內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用率能否保持穩(wěn)定，對于藍(lán)莓乳產(chǎn)品的開發(fā)有一定影響[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）；甲醇（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）；連苯三酚（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；碳酸鈉（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）；凝乳酶（美國Sigma公司）。

721型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；GL-21M高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；FE20實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；總糖度折光旋光儀（日本ATAGO愛拓）；hz-82震蕩型恒溫水浴鍋（金壇新航有限公司）；WB2000-D數(shù)字式攪拌器（德國WIGGENS公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍(lán)莓果漿樣品制備

速凍藍(lán)莓顆粒，常溫下水浴溶解6 h，完全解凍后，攪拌器內(nèi)粉碎攪拌至果漿溶液，經(jīng)0.150 mm孔徑篩過濾，保留過濾溶液，水浴攪拌加熱，在90 ℃、5 min條件巴殺滅菌，迅速冷卻降溫后，果漿濾液備用[4]。

1.2.2 發(fā)酵酸奶制備

稱取一定量純牛奶，將白砂糖與穩(wěn)定劑攪拌混勻，化料，過均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，巴氏殺菌冷卻接入發(fā)酵菌種，于42 ℃發(fā)酵至pH 4.6后熟，破乳、冷卻、二次巴氏殺菌，待裝。

藍(lán)莓全脂酸奶，化料后，加入濃度15%的藍(lán)莓果漿攪拌，均質(zhì)，后續(xù)流程同上。

1.2.3 滴定酸度的測定

按GB 5413.34—2010中規(guī)定方法執(zhí)行。

1.2.4 總固形物含量的測定

按GB 5413.39—2010中規(guī)定方法執(zhí)行。

1.2.5 多酚的提取

取10 g藍(lán)莓酸奶置于50 mL離心管中，加15 mL酸化甲醇（含0.05 mL濃鹽酸）有機(jī)溶劑，按10 000 r/min剪切提取1 min，于-20 ℃靜置30 min以使蛋白充分沉淀，按8 000 r/min、4 ℃離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾并用于多酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的測定。3 g藍(lán)莓果料與7 g去離子水混勻并作為藍(lán)莓果料的提取樣，8 g酸奶樣品與2 g去離子水混勻并作為各酸奶對照的提取樣，其他提取步驟同藍(lán)莓酸奶[5]。

1.2.6 多酚含量的測定

1.2.6.1 溶液配制

制備0.25 mol/L福林酚試劑，取2 mL原濃度福林酚試劑（2 mol/L）和14 mL蒸餾水，均勻混合。

制備15% Na2CO3溶液，取3 g Na2CO3·10 H2O溶于20 mL蒸餾水中。

連苯三酚標(biāo)準(zhǔn)溶液制備，準(zhǔn)確稱取10 mg連苯三酚標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液定容至50 mL，獲得0.2 mg/mL連苯三酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.6.2 樣品溶液制備

移取0.3 mL提取液于試管中，先加入0.3 mL福林酚試劑，充分混勻并靜置5 min，加入3 mL Na2CO3溶液，混勻并靜置10 min，用6.4 mL去離子水定容至10 mL，于50 ℃避光水浴8 min，在波長750 nm處讀取吸光度。以連苯三酚（0.025~0.25 mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用連苯三酚當(dāng)量表示（mg/100 g提取樣）[6]。

1.2.7 貯藏期內(nèi)酸奶抗氧化活性測定

1.2.7.1 貯藏期內(nèi)酸奶總抗氧化活力測定

取0.3 mL提取液，加0.7 mL甲醇稀釋，依次加入0.2 mL 1 mol/L HCl溶液、1.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 1%的SDS溶液和0.5 mL 0.2%的FeCl3溶液，混勻并用6.3 mL去離子水定容到10 mL，室溫靜置30 min，立即在750 nm處測吸光度。以VC（0.04~0.18 mg/mL）為陽性對照作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用VC當(dāng)量表示（mg/100 g提取樣）[7]。

1.2.7.2 貯藏期內(nèi)酸奶ABTS自由基清除能力測定

6.4 mmol/L ABTS和3.6 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，避光靜置12 h，作為ABTS+自由基儲備液，使用前將儲備液用pH 7.4醋酸鹽緩沖液稀釋，使其A734nm落在0.7±0.02范圍內(nèi)，即為工作液。在0.04 mL提取液中加入3 mL ABTS+工作液，避光靜置6 min，測其A734nm，并計算清除率。以VC（0.02~0.12 mg/mL）為陽性對照作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用VC當(dāng)量表示（mg/100 g提取樣）[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶基本成分分析

酸奶樣品的基礎(chǔ)組分分析見表1。結(jié)果表明，添加藍(lán)莓果漿的藍(lán)莓全脂酸奶相比全脂酸奶對照的總固體含量、脂肪、蛋白質(zhì)和酸度均有所提升（p＜0.05），同時其pH降低（p＜0.05），這是由于藍(lán)莓果漿本身果汁呈低酸性。發(fā)酵酸奶樣品的理化指標(biāo)均符合GB 19302—2010的理化指標(biāo)要求，符合開展加速貯藏試驗的要求[9]。

表1 酸奶基本成分分析

2.2 藍(lán)莓酸奶貯藏期多酚含量測定

以連苯三酚為標(biāo)準(zhǔn)品建立總酚質(zhì)量濃度與吸光度間的關(guān)系，結(jié)果如圖1所示，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=2.071 8x+0.088 0（R2=0.999 93），線性關(guān)系良好，可用于各樣品中總酚含量的測定。

圖1 連苯三酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

貯藏期間各樣品的總酚含量變化如圖2所示。藍(lán)莓全脂酸奶的總酚含量在1~21 d均呈下降趨勢（p＜0.05），分別從55.74±1.28 mg/100 g降至47.68±0.9 mg/100 g，21~28 d則保持相對穩(wěn)定，到28 d貯藏期結(jié)束時，藍(lán)莓酸奶總酚含量無顯著差異（p＞0.05），分別較初期水平降低14.65%[10]。全脂酸奶降幅不明顯；藍(lán)莓果漿的總酚含量在第14天達(dá)到最大值，為74.72±1.64 mg/100 g，到貯藏期結(jié)束時與初期水平相比降低0.87%（p＞0.05）。

圖2 貯藏期內(nèi)樣品多酚含量變化

結(jié)果表明，貯藏期間全脂酸奶、藍(lán)莓全脂酸奶的總酚含量變化差別不顯著（p＞0.05），但兩者的總酚含量及穩(wěn)定性均低于藍(lán)莓果漿[11]。

2.3 藍(lán)莓酸奶貯藏期抗氧化能力變化

2.3.1 貯藏期內(nèi)酸奶總抗氧化活力測定

以VC為標(biāo)準(zhǔn)品建立VC質(zhì)量濃度與吸光度間的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.172 9x-0.004 4（R2=0.999 4），線性關(guān)系良好，可用于各樣品中總抗氧化活力的測定。圖4所示為各樣品在貯藏期間的總抗氧化活力變化。

圖3 VC質(zhì)量濃度與總抗氧化活力標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 貯藏期內(nèi)各樣品抗氧化活力變化

分析樣品的變化趨勢可得，藍(lán)莓全脂酸奶的總抗氧化活力在1~14 d呈緩慢下降趨勢，從（45.81±1.47）mg/100 g降至（42.06±0.84）mg/100 g（p＜0.05），14~28 d呈上升趨勢，兩階段漲幅分別為2.52%和3.20%，全脂酸奶的降幅比較明顯，從24.77±0.9 mg/100 g降至18.56±1.61 mg/100 g；藍(lán)莓果漿的總抗氧化活力在第7天最大，為62.82±0.96 mg/100 g，到28 d結(jié)束時較初期降低0.58%，變化不顯著（p＞0.05）。

結(jié)果表明，藍(lán)莓果漿的添加雖然大幅提高酸奶對照的抗氧化活性，但與酸奶混合導(dǎo)致果漿的總抗氧化活力明顯降低，造成這種現(xiàn)象可能是藍(lán)莓酸奶中游離態(tài)酚類物質(zhì)含量低于藍(lán)莓果漿；酸奶體系中的脂肪含量也會對藍(lán)莓果漿的抗氧化活力造成影響[12-13]。

2.3.2 貯藏期內(nèi)酸奶ABTS自由基清除能力測定

以VC為標(biāo)準(zhǔn)品建立VC質(zhì)量濃度與ABTS+自由基清除率之間的關(guān)系，如圖5所示，得回歸方程y=1.010 6x+0.004 9（R2=0.999 1）。各樣品在貯藏期間的ABTS+自由基清除能力變化如圖6所示。

圖5 VC質(zhì)量濃度與ABTS+自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖6可知，藍(lán)莓全脂酸奶的ABTS+自由基清除能力顯著降低，分別從71.39±1.07 mg/100 g降至52.71±1.7 mg/100 g（p＜0.05），貯藏期降幅為26.1%，全酸奶的降幅較小，變化不顯著；藍(lán)莓果漿的ABTS+自由基清除能力在第7天達(dá)到最大值，為93.36±1.24 mg/100 g，貯藏末期較初期降低不顯著（p＞0.05），降幅為1.29%。

圖6 貯藏期內(nèi)樣品ABTS+自由基清除能力變化

結(jié)果表明，藍(lán)莓全脂酸奶的多酚-蛋白結(jié)合作用使得體系中能夠參與自由基清除的游離態(tài)多酚物質(zhì)含量降低，導(dǎo)致藍(lán)莓酸奶的總抗氧化活力和ABTS+自由基清除能力均低于藍(lán)莓果漿[14-15]。

2.4 藍(lán)莓酸奶貯藏期顏色變化

全脂酸奶和藍(lán)莓全脂酸奶之間亮度的顯著變化可能是由于藍(lán)莓果漿中存在的游離多酚和花青素導(dǎo)致光分子的吸收受到影響，同時在全脂酸奶28 d儲存期間，L*值的降低是由于乳蛋白分子間和分子內(nèi)反應(yīng)，導(dǎo)致光反射減少[16-17]。

a*（紅度）值的提升可能是由于藍(lán)莓果漿中存在的花青素，使藍(lán)莓全脂酸奶中呈現(xiàn)紫色。此外，藍(lán)莓果漿樣品的a*值在儲存期內(nèi)有所下降，在常溫儲存條件下貯藏21 d之前保持穩(wěn)定，表明花青素氧化過程緩慢進(jìn)行，藍(lán)莓全脂酸奶樣品a*值的降低可能是由于體系內(nèi)部游離的花青素隨著時間的增加不斷與體系中可氧化部分進(jìn)行絡(luò)合，花青素逐漸減少，整體顏色不斷改變[18]。

b*（黃度）值受添加藍(lán)莓果漿的影響，所以藍(lán)莓全脂酸奶比全脂酸奶表現(xiàn)出更高的b*值，并且在儲藏期內(nèi)沒有差異（p＞0.05）[19]。

表2 各樣品貯藏期內(nèi)顏色變化

3 結(jié)論

通過試驗和數(shù)據(jù)分析，試驗發(fā)現(xiàn)添加藍(lán)莓果漿的酸奶較全脂酸奶相比在整體多酚含量、抗氧化能力和ABTS清除自由基能力上有顯著提升，雖然藍(lán)莓全脂酸奶、全脂酸奶體系降低藍(lán)莓果漿總多酚物質(zhì)的含量和穩(wěn)定性，抗氧化能力也有所降低，但整體通過添加藍(lán)莓果漿可提升全脂酸奶的營養(yǎng)價值和生物利用性[20]。