GC-MS/MS結(jié)合QuEChERS法測(cè)定韭菜中多種農(nóng)藥殘留

洪澤淳，陳思敏，鄭悅珊，劉瑩瑩，李南，熊含鴻*

廣東省食品檢驗(yàn)所（廣州 510435）

韭菜在中國(guó)是一種普遍食用的蔬菜，在蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)中占有重要位置，其生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)過程中病蟲害較多，各種農(nóng)藥的使用不可避免[1]。韭菜中的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)一直是農(nóng)殘分析領(lǐng)域關(guān)注的難點(diǎn)問題，因?yàn)榫虏酥泻罅坑袡C(jī)硫化合物和辛辣物質(zhì)，會(huì)在樣品粉碎時(shí)釋放大量烯丙基甲基二硫醚、二甲基二硫醚和二丙烯基三硫醚等揮發(fā)性成分[2-3]，這些化合物與有機(jī)磷農(nóng)藥性質(zhì)相似，在氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器（GC-ECD）、氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器（GCFPD）和氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)器（GC-MS）上會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的響應(yīng)[4]，加上韭菜提取液中色素含量較高，基質(zhì)背景非常復(fù)雜，會(huì)嚴(yán)重干擾對(duì)韭菜中殘留農(nóng)藥的定性、定量分析。

農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)方法很多，有氣相色譜（GC）法[5]、液相色譜（LC）法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法[7]、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法[8]，與其他方法相比，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS/MS）法具有氣相色譜的高分離效能，又具有質(zhì)譜（二級(jí)質(zhì)譜）可鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，選擇性強(qiáng)、靈敏度高，能有效地降低基質(zhì)干擾，為化合物的測(cè)定提供準(zhǔn)確豐富的結(jié)構(gòu)信息，特別適用于背景干擾嚴(yán)重、定性困難的樣品分析，可同時(shí)快速測(cè)定樣品中多種殘留農(nóng)藥及其衍生物[9-12]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）是近年來發(fā)展起來的一種前處理技術(shù)，具有分析速度快、操作簡(jiǎn)單、回收率較高和價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(cè)[13-15]。通過改進(jìn)的QuEChERS前處理方法結(jié)合GC-MS/MS技術(shù)分析韭菜中多種農(nóng)藥殘留，充分發(fā)揮二者快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，既簡(jiǎn)化樣品的前處理，又有效避免基質(zhì)干擾，能進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，適合大批量韭菜樣品中多種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8040三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；Reeko AutoEVA-60型氮吹儀（睿科儀器有限公司）；IKA T25數(shù)顯型均質(zhì)機(jī)（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司）；Multi-Tube Vortexer多管漩渦混合儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Thermo ST8型離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）。

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)霍尼韋爾公司）；丙酮（色譜純）、無水硫酸鎂（分析純）、氯化鈉（分析純）（廣州化學(xué)試劑廠）；石墨化炭黑（GCB）粉末、N-丙基乙二胺（PSA）粉末、C18粉末（日本島津公司）；萃取鹽包（主要成分為4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，日本島津公司）；試驗(yàn)用水為超純水（德國(guó)Merck公司）。

韭菜樣品（市售）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：滅多威、敵敵畏、異丙威、治螟磷、甲拌磷、樂果、克百威、地蟲硫磷、甲基毒死蜱、3-羥基克百威、甲霜靈、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、甲基異柳磷、噻菌靈、α-硫丹、苯線磷、丙溴磷、β-硫丹、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：22種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液用丙酮稀釋配制成5.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)以乙酸乙酯稀釋至一定濃度進(jìn)行氣相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，用空白樣品基質(zhì)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成0，5，10，20，50和100 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取3.5 mg環(huán)氧七氯于100 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，得到5.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 樣品前處理

提?。簶悠方?jīng)粉碎勻漿后，稱取10 g（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈、萃取鹽包（4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉）和1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，漩渦混合振蕩3 min后按8 000 r/min離心5 min，上層乙腈層待凈化。

凈化：吸取6 mL乙腈層溶液加到內(nèi)含885 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA及15 mg GCB的15 mL塑料離心管中。漩渦混合振蕩3 min后按8 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取2 mL上清液，于40 ℃水浴氮吹至近干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用乙酸乙酯定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后，上機(jī)測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

VF-1701色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣，He；線速度47.2 cm/s；總流量30.0 mL/min；色譜柱流量1.69 mL/min；色譜柱溫度50 ℃；溫度程序：50 ℃（保持1 min），25 ℃/min升至125 ℃（保持0 min），以10 ℃/min升至300 ℃（保持1 min）；進(jìn)樣模式，不分流；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源采用EI源，70 eV；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲1.5 min；CID氣，氬氣；檢測(cè)器電壓（相對(duì)于調(diào)諧結(jié)果）0.60 kV；數(shù)據(jù)采集模式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇常用的22種農(nóng)藥（有機(jī)磷、有機(jī)氯、菊酯類、氨基甲酸酯類等）進(jìn)行方法學(xué)的研究考察。在全掃描模式下進(jìn)行掃描，獲得各化合物的保留時(shí)間和特征母離子，再進(jìn)行子離子掃描，選擇豐度較高、質(zhì)荷比較大、特征性強(qiáng)的離子作為子離子，同時(shí)優(yōu)化各化合物的碰撞能量。按照各化合物的出峰時(shí)間窗口特點(diǎn)及需要監(jiān)測(cè)離子的出峰順序，分時(shí)段分別監(jiān)測(cè)，同時(shí)控制每個(gè)時(shí)間段內(nèi)監(jiān)測(cè)的離子數(shù)目和駐留時(shí)間，確保目標(biāo)化合物在設(shè)定的掃描時(shí)間窗口出峰，且具有足夠的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)。22種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量定性的離子對(duì)以及碰撞電壓參數(shù)如表1所示。

表1 22種農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

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2.2 提取溶劑的選擇

由于農(nóng)藥品種多，結(jié)構(gòu)差異大且極性范圍廣，選擇萃取溶劑時(shí)應(yīng)綜合考慮提取溶劑的性質(zhì)需與目標(biāo)化合物相符，且目標(biāo)化合物在其中有良好的可溶性和穩(wěn)定性。在農(nóng)藥多殘留分析中，常用的提取溶劑有丙酮、乙腈和乙酸乙酯。丙酮的水溶性強(qiáng)，作為提取溶劑時(shí)，分層效果不明顯，難以實(shí)現(xiàn)有機(jī)溶劑與水完全分離，鹽析效果不如乙腈。乙腈的通用性較強(qiáng)，對(duì)多數(shù)農(nóng)藥均具有較高的提取效率，且乙腈極性較大，對(duì)基質(zhì)中的一些非極性的雜質(zhì)如油脂、蠟質(zhì)和葉綠素等提取較少，在去除雜質(zhì)方面效果較好。乙酸乙酯對(duì)農(nóng)藥的提取效率高，但容易將一些非極性親脂性的雜質(zhì)提取出來，與乙腈相比雜質(zhì)較多，干擾較大[16-18]。綜合考慮，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用的凈化劑有PSA、GCB和C18。PSA材料的有效成分為其表面鍵合的氨基，它對(duì)于樣品中的金屬離子、糖類、脂肪酸和親脂性色素等極性物質(zhì)具有良好的凈化作用，但對(duì)色素的凈化能力不理想。對(duì)于色素含量大的韭菜樣品，如果不能在凈化過程中去除干凈，將會(huì)造成嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。GCB凈化色素的能力較好，但由于其表面的六元環(huán)結(jié)構(gòu)會(huì)吸附一些平面及對(duì)稱結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，導(dǎo)致這些組分的回收率差，因此需要根據(jù)樣品色素含量對(duì)GCB的用量進(jìn)行優(yōu)化，使其既能起到凈化作用，又不降低農(nóng)藥的回收率。C18具有強(qiáng)疏水性，對(duì)于樣品中的色素和脂類等非極性雜質(zhì)有吸附作用。凈化步驟中使用無水硫酸鎂除掉有機(jī)提取液中多余水分，從而保護(hù)儀器[1,19-20]。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，試驗(yàn)選擇韭菜陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率比較，加標(biāo)量為50 μg/kg，分別考察4組凈化劑（配比見表2）對(duì)22種目標(biāo)農(nóng)藥回收率的影響，結(jié)果見圖1。

表2 凈化條件

從圖1可以看出，在4種凈化條件下，22種農(nóng)藥的平均回收率（即b值）均大于81%。根據(jù)試驗(yàn)觀察，C18和GCB可顯著降低韭菜乙腈提取液顏色深度，較澄清透明，平均回收率均高于未添加的第1組。在4種凈化條件下，回收率60%~120%的農(nóng)藥個(gè)數(shù)占總數(shù)（即a值）的50%~100%，其中，第4組最高，為100%，且其平均回收率為94.2%，明顯優(yōu)于另外3種方法，整體萃取效率高，因此，從節(jié)約成本、提高凈化效果綜合考慮，采用第4組作為最佳凈化條件。

圖1 4種不同凈化條件的對(duì)比

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

氣相色譜-質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)主要來自氣相色譜，以基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)為主，通常采用加入同位素內(nèi)標(biāo)、配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法減小其對(duì)定性定量分析的影響[16,21]。但因同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴、同位素標(biāo)記物種類有限、方法涉及農(nóng)藥品種較多，所以試驗(yàn)采用比對(duì)溶劑配標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)差異的方法來考察基質(zhì)效應(yīng)。對(duì)每種目標(biāo)化合物，用50 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與相同濃度溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積比例差異考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。

表3 22種農(nóng)藥在基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)

由表3可知，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)22種農(nóng)藥的響應(yīng)信號(hào)既有抑制作用也有增強(qiáng)作用，其中17種農(nóng)藥有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，只有滅多威、敵敵畏、3-羥基克百威、α-硫丹和β-硫丹5種農(nóng)藥表現(xiàn)出基質(zhì)抑制作用。因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液作校準(zhǔn)曲線來消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍及檢出限

采用韭菜空白基質(zhì)提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，繪制22種農(nóng)藥的基質(zhì)基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在已優(yōu)化好的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，在MRM模式下采集的22種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見圖2。以目標(biāo)化合物濃度（X）為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限（LOQ），如表4所示。結(jié)果表明，22種農(nóng)藥在5~100 μg/L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.995 73~0.999 91之間。根據(jù)GB 2763—2019[22]的規(guī)定，韭菜中各種農(nóng)藥殘留的限量均不低于10 μg/kg，22種農(nóng)藥的定量限均在10 μg/kg范圍內(nèi)，滿足相關(guān)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)韭菜中農(nóng)藥殘留限量及分析方法的要求。

圖2 22種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在MRM模式下總離子流色譜圖

表4 22種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.5.2 加標(biāo)樣品的回收率和精密度

在韭菜陰性樣品中，添加0.01，0.04和0.07 mg/kg這3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)制備平行樣品，按照1.3進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定后進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度計(jì)算，結(jié)果見表5。22種農(nóng)藥在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為61.3%~115.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.5%~9.4%，說明試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

表5 樣品中3個(gè)水平加標(biāo)下22種農(nóng)藥的回收率（n=3）和精密度（n=7）

2.5.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用試驗(yàn)所建立的方法對(duì)市售的60份韭菜樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出農(nóng)藥殘留7種，其中，8份樣品檢出氯氟氰菊酯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.020~1.20 mg/kg；5份樣品檢出毒死蜱，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.024~0.21 mg/kg；2份樣品檢出敵敵畏，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.014和0.030 mg/kg；2份樣品檢出克百威，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.012和0.013 mg/kg；1份樣品檢出水胺硫磷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.28 mg/kg；1份樣品檢出樂果，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.036 mg/kg；1份樣品檢出滅多威，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.013 mg/kg。其余樣品均未檢出上述22種農(nóng)藥殘留。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）同時(shí)測(cè)定韭菜中22種農(nóng)藥殘留的方法。韭菜勻漿經(jīng)乙腈提取，以QuEChERS法為前處理技術(shù)，優(yōu)化MgSO4、PSA、GCB用量，在質(zhì)譜MRM模式下檢測(cè)，基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，22種農(nóng)藥在5~100 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.995 73~0.999 91，加標(biāo)回收率在61.3%~115.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，定量限為0.003~0.01 mg/kg。該方法具有前處理溶劑用量少、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、效率高等特點(diǎn)，易于批量操作，且GC-MS/MS在定性定量方面具有優(yōu)勢(shì)，能夠有效地避免雜質(zhì)的干擾，同時(shí)篩查多種農(nóng)藥殘留，降低分析成本。通過韭菜陰性樣品加標(biāo)，方法獲得較高回收率，滿足日常的農(nóng)藥殘留痕量分析工作，且成功用于實(shí)際樣品分析，表明試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，適用于韭菜中多種農(nóng)藥的同時(shí)快速測(cè)定。