DSPE-LC-MS/MS法測定泥鰍中16種喹諾酮類藥物殘留

唐秀 ，范廣宇*，宋蘇，梁夏夏，王文彬*，姚燕林

1. 江蘇海洋大學(xué)（連云港 222005）；2. 連云港海關(guān)（連云港 222042）

泥鰍在我國分布廣泛，其肉味道鮮美且富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸、多種礦物元素及B族維生素，素有“水中人參”之美譽，具有較高的營養(yǎng)價值[1-2]，深受國內(nèi)外消費者喜愛。江蘇省連云港市作為全國泥鰍養(yǎng)殖和出口的重要地區(qū)，出口活泥鰍已有近20年的歷史[3]，一直占據(jù)著韓國絕大部分市場份額。喹諾酮類（quinolones，QNs）藥物具有抗菌譜廣、抗菌力強、安全性高、價格低廉、毒副作用低等特性，被長期廣泛應(yīng)用于泥鰍養(yǎng)殖中，但使用不當(dāng)會造成喹諾酮類藥物在泥鰍體內(nèi)殘留，對人體構(gòu)成潛在威脅。近年來韓國等主要進(jìn)口國對泥鰍的藥物殘留要求越來越高，輸往韓國的養(yǎng)殖水產(chǎn)品中諾氟沙星、培氟沙星和氧氟沙星的限量要求不得檢出，據(jù)中國技術(shù)性貿(mào)易措施網(wǎng)數(shù)據(jù)，2017年以來韓國因喹諾酮類超標(biāo)扣留我國出口泥鰍8批次。

目前，喹諾酮類藥物檢測常用的方法有免疫分析法[4-5]、毛細(xì)管電泳法[6]、液相色譜法[7-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-16]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[17]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的分析時間短，檢出限低，準(zhǔn)確性和靈敏度高，在喹諾酮類藥物殘留檢測中應(yīng)用較廣。泥鰍基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及色素等雜質(zhì)，儀器檢測之前需要去除，處理不當(dāng)將影響藥物殘留的檢測，造成結(jié)果不準(zhǔn)確、儀器污染等，因此樣品的前處理尤為重要[18]。水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測廣泛采用的前處理方法主要有固相萃取法[7,15,19,22]、液液萃取法[20]、分子印跡法[21]、加速溶劑萃取法[6,22]、分散固相萃取法[8,23-24]等。分散固相萃?。╠ispersive solid-phase extraction，DSPE）法是直接在提取液中加入固相吸附劑凈化然后測定，具有快速、簡單、靈活等特點，可用于不同性質(zhì)藥物的快速篩查。分散固相萃取法用于泥鰍中喹諾酮類藥物檢測的研究較少，此次試驗基于分散固相萃取和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立一種同時檢測泥鰍中16種喹諾酮類藥物殘留的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；Analyst工作站；XS 204分析天平，瑞士Mettler公司；KH-800KDB型高功率數(shù)控超聲波，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；A10 Milli-Q超純水機，美國Millipore公司；TDL-40B型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；N-EVAP 112氮吹儀，美國Organomation公司；XW-80A型漩渦混合器，上海青浦滬西儀器廠。

恩諾沙星（enrofloxacin）、麻保沙星（marbofloxacin）、奧比沙星（orbifloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、氟羅沙星（fleroxacin）、培氟沙星（pefloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、司帕沙星（sparfloxacin）、丹諾沙星（danofloxacin）、依諾沙星（enoxacin）、萘啶酸（nalidixic acid）、氟甲喹（flumequine）、雙氟沙星（difloxacin）、沙拉沙星（sarafloxacin）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）、洛美沙星（lomefloxacin），德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度＞92%；環(huán)丙沙星-D8（ciprofloxacin-D8）、恩諾沙星-D5（enrofloxacin-D5）、諾氟沙星-D5（norfloxacin-D5）、培氟沙星-D5（pefloxacin-D5）、氧氟沙星-D3（ofloxacin-D3），德國Witega公司，純度＞99%；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18），美國Agilent公司；中性氧化鋁吸附劑（Alumina-N），上海安譜實驗科技股份有限公司；硅鎂型吸附劑（Florisil），上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，德國Merck公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、甲酸、乙酸，均為優(yōu)級純，中國國藥試劑公司。試驗用水為超純水。樣品購自本地市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

儲備液：準(zhǔn)確稱取適量上述標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取一定量的單標(biāo)儲備液，用初始流動相稀釋成1 mg/L的16種喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mg/L的5種氘代內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用之前再稀釋至所需濃度。

1.3 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，從1 mg/L的內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中取25 μL加入樣品中，加入10 mL含2%（V/V）乙酸的乙腈旋渦混勻，然后超聲提取10 min，加入5 g無水Na2SO4旋渦混勻2 min，以3 500 r/min離心后取5 mL上清液氮吹至干，用1 mL甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液溶解定容，加入60 mg PSA漩渦混勻1 min，以3 500 r/min離心后取上清液過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.4 液相色譜條件

ACE UltraCore 2.5 Super C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；流動相，0.1%（V/V）甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序：0~3.5 min，10% B~35% B；3.5~6 min，35% B~90% B；6~7 min，90% B；7~7.1 min，90% B~10% B；7.1~10 min，10% B。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；去溶劑溫度（TEM）為500 ℃；電噴霧電壓（IS）為5.5 kV；入口電壓（EP）和碰撞室出口電壓（CXP）分別為10和6 V；所用氣體均為高純氮氣；碰撞氣（CAD）、氣簾氣（CUR）、霧化氣（GS1）、輔助氣（GS2）的壓力分別為41.4，207，345和345 kPa。16種喹諾酮類藥物和5種氘代內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 16種喹諾酮類藥物及5種內(nèi)標(biāo)物的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓和去簇電壓

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

考察了甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液和乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相時目標(biāo)化合物的響應(yīng)值、分離效果和色譜峰形。結(jié)果表明，相比前者，后者色譜峰分離度和峰型不好，故選擇甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相進(jìn)行分離。在優(yōu)化條件下，16種喹諾酮類藥物的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 16種喹諾酮類藥物的提取離子色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式注入0.1 mg/L的16種喹諾酮類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.2 mg/L的5種氘代喹諾酮類內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，ESI正離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，確定每種藥物的母離子，再對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選取兩個相對豐度較高的碎片離子分別作為定量和定性離子，優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓，優(yōu)化后參數(shù)見表1。

2.3 提取條件的優(yōu)化

乙腈有較好的去除蛋白質(zhì)的作用，不僅對蛋白質(zhì)具有良好的沉淀、去除效果，也對脂類、高疏水性化合物等雜質(zhì)具有良好的去除效果，而泥鰍樣品中的蛋白質(zhì)含量較高，因此選擇乙腈作為提取溶劑。試驗對比了純乙腈、2%乙酸-乙腈和2%甲酸-乙腈的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶劑中加入酸后平均回收率明顯增加，有助于目標(biāo)檢測物的提取。同時發(fā)現(xiàn)2%乙酸-乙腈和2%甲酸-乙腈的提取效果差別不大，考慮到甲酸的酸性和腐蝕性均大于乙酸，所以選取2%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

試驗還對比了超聲0，5，10，15和20 min的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲10 min即可得到最佳的回收率。

2.4 凈化條件的選擇

分散固相萃取法可以避免固相萃取柱繁瑣和耗時的過程，因此選擇分散固相萃取法對樣品進(jìn)行提取凈化并研究凈化條件的影響。對比了5 g無水Na2SO4、1 g NaCl+4 g無水Na2SO4、1 g NaCl+4 g無水MgSO4的影響，結(jié)果顯示使用無水MgSO4回收率明顯降低，而只加無水Na2SO4的平均回收率最好。

試驗分別對比了100 mg PSA、100 mg C18、100 mg Florisil、100 mg Alumina-N、50 mg PSA+50 mg C18和50 mg PSA的凈化效果，結(jié)果表明，單獨使用PSA時的凈化效果好于C18、Florisil和Alumina-N，PSA和C18同時使用時沒有明顯差異，因此選擇單獨使用PSA。

進(jìn)一步對比了不同用量的PSA對目標(biāo)化合物回收率的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)PSA用量達(dá)到60 mg時，回收率在70%~110%之間的目標(biāo)化合物最多；當(dāng)用量超過60 mg后，回收率低于70%的目標(biāo)化合物明顯增多，因此凈化劑選取60 mg PSA。

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系、檢出限和定量限

分別配制質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5，1，5，10和20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度均為1 μg/L。以各目標(biāo)物定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，線性關(guān)系良好。以S/N≥3確定檢出限（LOD），以S/N≥10確定方法的定量限（LOQ），具體數(shù)值見表2。

表2 16種喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2 精密度與回收率

采用空白泥鰍樣品進(jìn)行添加回收試驗，加標(biāo)水平分別為1，2和10倍定量限，按照1.3小節(jié)處理，每個水平重復(fù)測定6次，16種喹諾酮類藥物的平均回收率為60.0%~112.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%~13.3%，方法的回收率和精密度結(jié)果見表3。

表3 16種喹諾酮類藥物的回收率和精密度（n=6）

2.5.3 實際樣品測定

將該方法應(yīng)用于18批泥鰍樣品的檢測，其中檢出5批次恩諾沙星、2批次環(huán)丙沙星和2批次氧氟沙星，含量范圍分別為0.5~28.5，0.7~6.3和0.2~0.6 μg/kg，說明泥鰍中喹諾酮類藥物殘留風(fēng)險較大。

3 結(jié)論

利用分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立同時檢測泥鰍中16種喹諾酮類藥物的分析方法。將該方法應(yīng)用于泥鰍樣品檢測，其中有多批次樣品檢出喹諾酮類藥物殘留。該方法簡便、快速、靈敏度高，能夠?qū)悠分械哪繕?biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，可用于泥鰍樣品中16種喹諾酮類藥物的快速檢測，在提高泥鰍出口監(jiān)管工作效率方面具有重要意義。