響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助堿法制備殼聚糖工藝

陳蒙，蘭孝維，柏韻，常寶賢，張振*，李丹丹*

錦州醫(yī)科大學(xué)（錦州 121000）

殼聚糖被稱為可溶性甲殼質(zhì)，是自然界中存在較多的多糖之一[1-2]，因其安全無毒、生物降解性和成膜性好，且成本較低[3-5]，在食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6]。殼聚糖是來源于藻類植物、軟體動(dòng)物、昆蟲等的甲殼素脫乙酰度大于70%后形成的產(chǎn)物[7-10]。脫乙酰度的高低直接影響殼聚糖的性質(zhì)及其應(yīng)用，因此，如何獲得高脫乙酰度的殼聚糖至關(guān)重要。

甲殼素脫乙酰制備殼聚糖常用的方法包括微生物法、堿法和物理法。其中，微生物法是利用高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶制備殼聚糖的一種方法，該方法有利于環(huán)保，但該酶的篩選、分離要求較高的條件，工藝控制復(fù)雜，周期較長(zhǎng)，限制其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[11-12]。堿法是甲殼素脫乙酰的傳統(tǒng)工藝方法，氫氧化鈉是最常用的堿液。大量研究表明一次浸堿法得到的殼聚糖脫乙酰度較低，多次重復(fù)堿液提取可提高殼聚糖的脫乙酰度和黏度，但缺點(diǎn)在于其耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)濃堿不利回收，易產(chǎn)生廢液，對(duì)環(huán)境污染較大。常用的物理輔助方法包括超聲波法和微波法，研究顯示，物理法輔助可將多數(shù)化學(xué)反應(yīng)的時(shí)間縮短，提高反應(yīng)效率，減少化學(xué)試劑的用量。許慶陵等[11]利用超聲輔助堿液法制備的殼聚糖脫乙酰度值可達(dá)90%以上。因此，為提高殼聚糖的脫乙酰度、優(yōu)化殼聚糖制備工藝，以實(shí)驗(yàn)室自制的甲殼素為原料，采用微波輔助堿法制備殼聚糖，研究甲殼素顆粒度、微波功率、液料比、堿液質(zhì)量濃度等因素對(duì)脫乙酰度的影響，以期獲得制備較高脫乙酰度殼聚糖的最優(yōu)工藝條件，為殼聚糖工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

甲殼素（自制，以中國(guó)對(duì)蝦蝦殼為原料，按照前期實(shí)驗(yàn)所得[14]的制備方法制備顆粒大小0.600 mm（30目）的甲殼素）；鹽酸、甲基橙、NaOH、苯胺藍(lán)（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（HHS-21-8型，天津市泰斯特儀器有限公司）；分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140型，上海一恒科技有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（UV-6300型，上海美譜達(dá)儀器有限公司）；高速粉碎機(jī)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖的制備工藝

稱取10 g甲殼素置于聚四氟燒杯中，按照一定液料比加入NaOH溶液，反應(yīng)一段時(shí)間后，采用磁力攪拌均勻，2 h后將反應(yīng)物移入微波裝置，在不同微波功率條件下反應(yīng)10 min，冷卻，過濾，水沖洗至中性，在105 ℃條件下干燥至恒重，測(cè)制備的殼聚糖脫乙酰度及NaOH溶液濃度。

1.2.2 殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定

稱取2份殼聚糖樣品，各0.2~0.3 g，其中一份溶解于30 mL 0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液中，加入2~3滴甲基橙-苯胺藍(lán)混合指示劑（1∶2，V/V），用0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定。另一份殼聚糖樣品置于105 ℃烘箱烘干至恒重后，測(cè)定水分。按式（1）和（2）計(jì)算。

式中：C—NH2為氨基含量；Y為殼聚糖脫乙酰度；A1和A2為HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液和NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1和V2為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液和NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g；W為試樣中水分含量；0.016為與1 mL 1 mol/L HCl溶液相當(dāng)?shù)陌绷浚琯；9.94%為殼聚糖中理論氨基含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 堿液質(zhì)量濃度對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

固定液料比15∶1（mL/g）、微波功率500 W，考察NaOH溶液濃度25 g/100 mL，35 g/100 mL，45 g/100 mL，55 g/100 mL和65 g/100 mL對(duì)制備的殼聚糖脫乙酰度的影響。

1.2.3.2 液料比對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

固定NaOH溶液濃度45%、微波功率500 W，考察液料比5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1（mL/g）對(duì)制備的殼聚糖脫乙酰度的影響。

1.2.3.3 微波功率對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

固定NaOH溶液濃度45%、液料比15∶1（mL/g），考察微波功率200，300，400，500和600 W對(duì)制備的殼聚糖脫乙酰度的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)，以堿液質(zhì)量濃度（A）、液料比（B）、微波功率（C）作為考察因子，殼聚糖脫乙酰度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)表1響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Duncan法進(jìn)行顯著性（p＜0.05），并采用Excel作圖，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析采用Design-Expert 8.0.6.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 堿液質(zhì)量濃度對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度的影響

堿液質(zhì)量濃度變化對(duì)制備的殼聚糖脫乙酰度影響如圖1所示。堿液質(zhì)量濃度25 g/100 mL，所得殼聚糖的脫乙酰度僅77.6%，脫乙酰度較低的原因在于NaOH為親核劑，較低的NaOH濃度與甲殼素分子中乙?；g產(chǎn)生的親和力較小，不利于脫乙酰反應(yīng)的進(jìn)行。隨著堿液質(zhì)量濃度逐漸升高，殼聚糖脫乙酰度有所增加，當(dāng)堿液質(zhì)量濃度達(dá)到55 g/100 mL時(shí)，所得殼聚糖脫乙酰度最高，為95.8%，之后堿液質(zhì)量濃度再升高，殼聚糖脫乙酰度反而有所下降。因此堿液質(zhì)量濃度選擇55 g/100 mL。

圖1 堿液質(zhì)量濃度變化對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度影響

2.1.2 液料比對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度的影響

液料比變化對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度影響如圖2所示。隨著液料比增大，所得殼聚糖的脫乙酰度有所增加。這是因?yàn)殡S著液料比增大，堿液用量增加，甲殼素與堿液混合更均勻，反應(yīng)更徹底。液料比達(dá)到15∶1（mL/g），脫乙酰度達(dá)到94.9%，隨著液料比增加，所得殼聚糖的脫乙酰度略有升高，但變化并不顯著（p＜0.05）。因此，液料比選擇15∶1（mL/g）。

圖2 液料比變化對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度影響

2.1.3 微波功率對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度的影響

微波功率變化對(duì)制備的殼聚糖脫乙酰度影響如圖3 所示。殼聚糖脫乙酰度隨著微波功率增加先升高而后減小，微波功率500 W時(shí)，殼聚糖脫乙酰度達(dá)到最高，為94.4%。微波輻射作用促進(jìn)甲殼素脫乙酰反應(yīng)，但過高的功率使反應(yīng)過程中液料比發(fā)生變化，不利于脫乙酰反應(yīng)[16]。因此，微波功率選擇500 W。

圖3 微波功率變化對(duì)所得殼聚糖脫乙酰度的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與驗(yàn)證

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

表2 ~表4顯示響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果、方差分析結(jié)果及二階多項(xiàng)式回歸模型。方差分析表明F=28.6，p＜0.01，極顯著，而失擬項(xiàng)不顯著（p=0.975 9＞0.05），相關(guān)系數(shù)R2為0.980 9，修正系數(shù)Radj2為0.946 7，說明方程具有較好擬合度，該模型可靠，可以解釋94.67%的響應(yīng)值變化。因此，該模型可靠，所得方程可用于確定微波輔助堿法制備殼聚糖最優(yōu)工藝。影響殼聚糖脫乙酰度的因素依次為A（堿液質(zhì)量濃度）＞B（液料比）＞C（微波功率），其中，A（堿液質(zhì)量濃度）極顯著（p＜0.01），AB，AC具有極顯著的交互作用（p＜0.01）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析表

表4 二階多項(xiàng)式回歸模型分析

2.2.2 響應(yīng)曲面和等高線分析

響應(yīng)曲面斜率與響應(yīng)值變化正相關(guān)，而等高線反映2個(gè)因素之間的交互作用大小，越接近圓形，交互作用則越弱[16]。圖4~圖6顯示3個(gè)因素間的響應(yīng)曲面和等高線，A（堿液質(zhì)量濃度）與B（液料比），A（堿液質(zhì)量濃度）與C（微波功率）交互作用明顯，B（液料比）與C（微波功率）等高線輪廓幾乎呈圓形，表明液料比與微波功率沒有交互影響殼聚糖脫乙酰度。

圖4 堿液質(zhì)量濃度和液料比對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

圖6 液料比和微波功率對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

2.2.3 微波輔助堿法制備殼聚糖最佳工藝參數(shù)確定

使用Design-Expert 8.0.6.1軟件確定微波輔助堿法制備殼聚糖最佳工藝參數(shù)：堿液質(zhì)量濃度58.73 g/100 mL、液料比16.30∶1（mL/g）、微波功率518.69 W，為便于設(shè)定，修訂參數(shù)為堿液質(zhì)量濃度58 g/100 mL、液料比16∶1（mL/g）、微波功率520 W。在此工藝條件下，殼聚糖脫乙酰度為94.7%，與預(yù)測(cè)值95.17%接近，表明模型有效，可以預(yù)測(cè)微波輔助堿法制備殼聚糖脫乙酰度。

圖5 堿液質(zhì)量濃度和微波功率對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

表5 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證

3 結(jié)論

以殼聚糖脫乙酰度為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定微波輔助堿法制備殼聚糖的最佳工藝條件為堿液質(zhì)量濃度58 g/100 mL、液料比16∶1（mL/g）、微波功率520 W。在此條件下殼聚糖脫乙酰度得到提高，達(dá)94.7%，后續(xù)可深入研究微波輔助提高殼聚糖脫乙酰度的反應(yīng)機(jī)制。