黃精糖化和發(fā)酵工藝優(yōu)化

葉文峰，王紫薇，于苗苗，關愛國

1. 宜春學院化學與生物工程學院（宜春 336000）；2. 江西科技職業(yè)學院（南昌 330200）

黃精是一種藥食同源的滋補佳品，主要有降低血糖和血脂、調節(jié)免疫力、抗炎抗菌等作用[1-3]，常用于功能食品的開發(fā)。我國黃精資源豐富，目前對黃精的研究多以黃精化學成分、藥理作用及黃精多糖功效等為主，對黃精深加工工藝的研究還處于起步階段[4]。目前，市場上已出現(xiàn)膠囊、糖漿、茶、面膜等產品，如“可溶性黃精紅景天功能食品”[5]，但關于黃精利用乳酸菌發(fā)酵的飲料這方面的研究還比較少[6]。服用生黃精時，口腔有麻味，對咽喉有刺激[7]，處理不當無法最大程度發(fā)揮其功效。根據(jù)現(xiàn)有研究，目前處理黃精的方法主要有干燥法、煮制法、蒸制法，但這些加工方法會使黃精中水溶性成分流失，損失較大[8]。而與傳統(tǒng)加工法相比，發(fā)酵法對提高黃精抗氧化能力及降低刺激性更為突出，且能最大限度地保留黃精中的有效成分[9]。

黃精化學成分中含量最多的是糖類物質，其中淀粉含量為25.1%[10]，糖化酶可以將淀粉分解為還原糖，利于乳酸菌吸收利用[11]，促進乳酸菌生長繁殖，提高發(fā)酵產物的積累。發(fā)酵起到破壁作用，促進活性物質溶出[12]。黃精發(fā)酵后可降低食用黃精后口腔的麻感，減輕對咽喉的刺激，同時使代謝產物之間相互協(xié)調，可改善產品風味，提高產品營養(yǎng)價值。試驗以鮮黃精為原料，優(yōu)化糖化工藝和發(fā)酵工藝，為黃精發(fā)酵飲料的開發(fā)提供參考[13]。

1 材料、試劑及設備

1.1 材料與試劑

黃精（新鮮飽滿、棕黃色、無損壞）；保加利亞乳桿菌（校生物實驗室培養(yǎng)）；糖化酶（20萬 U/g）；脫脂乳粉、瓊脂、檸檬酸（食品級，符合國家國標標準）；3, 5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、無水葡萄糖（均為分析純）；MRS培養(yǎng)基（保加利亞乳桿菌培養(yǎng)）。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司）；紫外分光光度計（UV-752N，上海佑科儀器儀表有限公司）；數(shù)電熱恒溫干燥箱（202-A型，上海陽光實驗儀器有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（寧波久興醫(yī)療器械有限公司）。

2 試驗方法

2.1 黃精糖化試驗

2.1.1 還原糖測定

2.1.1.1 還原糖測定方法

3, 5-二硝基水楊酸（DNS）法測還原糖是一種準確性高、重現(xiàn)性好的方法[14]，經(jīng)常被人們使用。還原糖含量計算公式：還原糖=查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)/樣品毫克數(shù)×100%[15]。

2.1.1.2 標準葡萄糖曲線的繪制

無水葡萄糖烘干（105 ℃）至恒重，準確稱取133.0 mg，溶解，定容至100 mL，即得標準葡萄糖溶液，質量濃度為1.33 g/L。

準確量取0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL標準葡萄糖溶液于6個20 mL具塞試管中，補入蒸餾水至1 mL，加入2 mL DNS試液，搖勻后置沸水中保溫5 min，取出后用流水冷卻至室溫，加蒸餾水至10 mL，搖勻，即得標準曲線待測液。以0號試管為對照，測定標準葡萄糖溶液在540 nm波長處的吸光度?？v坐標表示吸光度，橫坐標表示葡萄糖質量濃度，繪制標準曲線，得到的標準曲線為Y=15.147X-0.130 6（r=0.999 6），其在0.068~0.876 mg范圍內線性關系良好[16]。葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1.1.3 樣品中還原糖含量的測定

以糖化液為樣品，參照2.1.1.2中的方法進行測定。

2.1.2 黃精糖化工藝

黃精清洗去皮→打漿→糊化→調節(jié)pH→糖化→黃精糖化液→測定糖化液還原糖含量 糖化酶↗

2.1.3 單因素試驗

通過預試驗可知料液比、糖化時間、糖化酶添加量對糖化工藝的影響較大，故選擇這3個因素進行單因素試驗。

2.1.3.1 料液比對黃精糖化試驗的影響

將黃精按照不同的料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）進行打漿，用檸檬酸調節(jié)pH至4，加入2%的糖化酶，在60 ℃的水浴鍋中放置3 h，糖化完成后煮沸滅酶。依照標準葡萄糖測定方法測定不同料液比時黃精糖化液的還原糖含量。

2.1.3.2 糖化時間對黃精糖化試驗的影響

黃精以料液比1∶30（g/mL）打漿，用檸檬酸調節(jié)pH至4，在水浴鍋中加熱至60 ℃，加入2%的糖化酶，設定糖化時間2，3，4，5和6 h，糖化完成后煮沸使酶喪失活性。按照標準葡萄糖的方法測定不同糖化時間下黃精糖化液的還原糖含量。

2.1.3.3 糖化酶添加量對黃精糖化試驗的影響

取黃精以料液比1∶30（g/mL）打漿，檸檬酸調節(jié)pH至4，加入1%，1.5%，2%，2.5%和3%的糖化酶，在60 ℃的水浴鍋中糖化3 h，糖化完成，測定不同酶添加量下黃精糖化液的還原糖含量。

2.1.4 黃精糖化工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取每個因素的水平范圍，設計正交試驗，見表1，確定黃精糖化最優(yōu)條件。

表1 黃精糖化正交試驗因素水平表

2.2 黃精發(fā)酵液發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗

2.2.1 菌種的活化[17]

選用保加利亞乳桿菌作為發(fā)酵劑制備的菌種，將生理鹽水和保加利亞乳桿菌凍干粉的混合溶液接種在MRS固體培養(yǎng)基中，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到菌苔布滿1/2以上培養(yǎng)皿為止。配制10%脫脂乳，與其他儀器一起在高壓蒸汽滅菌鍋中殺菌，放入超凈工作臺中冷卻。用接種環(huán)挑取MRS培養(yǎng)基上的乳酸桿菌，將其接種到滅菌脫脂乳中，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至凝乳，然后再將錐形瓶中菌種接種于10%脫脂乳中培養(yǎng)。經(jīng)3~5次活化，最后凝固時間在5 h內認為是活化完成。

2.2.2 菌種的馴化[18-19]

為了使乳酸菌能夠在黃精糖化液中更好地生長，必須對菌種進行馴化。馴化方法參照文獻[18]中的方法，活化后的菌種以3%的接種量接種于不同比例混合的黃精糖化液和脫脂乳培養(yǎng)基中。逐漸增加黃精糖化液的比例，馴化3~5次，直到乳酸菌能在低含量脫脂乳粉存在的黃精糖化液中正常生長，馴化后的菌種放入0~4 ℃的冰箱中保存。

2.2.3 黃精發(fā)酵單因素試驗

經(jīng)查閱資料了解到發(fā)酵時間、發(fā)酵劑添加量及奶粉添加量對發(fā)酵工藝的影響比較明顯，故選這三個因素做單因素試驗。

2.2.3.1 發(fā)酵時間對黃精糖化液發(fā)酵試驗的影響

各取30 mL黃精糖化液置于5個錐形瓶中，加入0.2%的脫脂乳粉后搖勻，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15 min，取出放入超凈工作臺中冷卻，接入5%的菌種，搖勻，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)10，12，14，16和18 h，取出放入0~4 ℃的冰箱中保存，以待后續(xù)感官評價。

2.2.3.2 發(fā)酵劑添加量對黃精糖化液發(fā)酵試驗的影響

取5個錐形瓶，各加入30 mL黃精糖化液，加入0.2%的脫脂乳粉，搖勻，滅菌，冷卻，各接種3%，4%，5%，6%和7%的發(fā)酵劑，搖勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后取出，存放于0~4 ℃的冰箱中備用。

2.2.3.3 脫脂乳粉添加量對黃精糖化液發(fā)酵試驗的影響

取5個錐形瓶，各加入30 mL黃精糖化液，再依次加入0，0.1%，0.2%，0.3%和0.4%的脫脂乳粉，搖勻后滅菌，取出放入超凈工作臺冷卻，接種5%的發(fā)酵劑，搖勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后取出，放于0~4 ℃的冰箱中備用。

2.2.4 響應面法優(yōu)化黃精發(fā)酵液工藝條件

以響應值為感官評分，在發(fā)酵單因素試驗的基礎上，選取發(fā)酵時間、脫脂奶粉添加量和發(fā)酵劑添加量為考察因素，設計響應面試驗，試驗因素和水平見表2。

表2 響應面優(yōu)化黃精發(fā)酵的因素與水平

2.2.5 感官評分標準

選擇20名無特殊口味偏好的食品專業(yè)學生對黃精發(fā)酵液進行感官評定，滿分為100分，具體評分標準參考文獻[13]，詳見表3。

表3 黃精發(fā)酵液感官評分標準

3 試驗結果分析

3.1 黃精糖化工藝結果分析

3.1.1 料液比單因素試驗結果由圖2可知，隨著黃精中加水量的增加，還原糖含量先增加后減少，當料液比為1∶30（g/mL）時還原糖含量最高。黃精漿中加水量低，黃精漿過于黏稠，溶出的可利用物過少，不利于糖化；加水量過多，原料過度稀釋，也不利于糖化。故選取料液比1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）為三水平做優(yōu)化試驗。

圖2 料液比對糖化試驗的影響

3.1.2 糖化酶添加量單因素試驗

由圖3可知，糖化酶添加量在2%時，糖化液的還原糖含量最高。隨著糖化酶添加量增加，還原糖含量變化不明顯，這是由于一定量底物存在與之相適應的最大酶用量，若存在過多的酶，則無法與底物結合，不能提高還原糖含量。故選擇酶添加量1.5%，2%和2.5%為三水平做優(yōu)化試驗。

圖3 糖化酶添加量對糖化試驗的影響

3.1.3 糖化時間單因素試驗

由圖4可以看出，還原糖含量隨著糖化時間的增加而不斷增加，到4 h時達到最大，之后趨于穩(wěn)定，這是由于一定量黃精中的可利用物質完全與糖化酶的活性中心結合需要一定的時間，底物與酶完全結合后產物的量趨于穩(wěn)定。故選取3，4和5 h為三水平做優(yōu)化試驗。

圖4 糖化時間對糖化試驗的影響

3.1.4 糖化工藝優(yōu)化試驗結果及分析

由表4可以看出，黃精糖化最佳工藝為A3B2C3，即料液比1∶40（g/mL），糖化酶添加量2%，糖化時間5 h。由極差分析得到影響因素C＞B＞A，糖化時間顯著性最高，其次是糖化酶添加量，顯著性最低的是料液比。為了進一步確定試驗結果，按照最優(yōu)條件進行黃精糖化驗證試驗，糖化液中還原糖含量為22.46%，正交優(yōu)化結果可信。所以，黃精糖化試驗最佳條件為料液比1∶40（g/mL）、糖化酶添加量2%、糖化時間5 h。

表4 黃精糖化工藝優(yōu)化試驗結果

3.2 發(fā)酵試驗結果

3.2.1 發(fā)酵時間的確定

由圖5可以看出，發(fā)酵時間從10 h到14 h，感官評分逐漸上升，到14 h時感官評分達到最高，隨后又逐漸降低。這是因為開始階段乳桿菌細胞數(shù)不足，無法充分利用培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質，發(fā)酵產物和風味物質形成較少，氣味寡淡，殘渣較多，顏色透亮度低；隨著發(fā)酵時間的延長，14 h時發(fā)酵液各方面均達到最優(yōu)，這時發(fā)酵時間再延長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質減少，次生代謝產物積累會不利于菌體生長[20]，甚至出現(xiàn)酸甜不協(xié)調的情況，因此選定12，14和16 h為響應面設計的三水平。

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵結果的影響

3.2.2 發(fā)酵劑添加量的確定

由圖6可知，感官評分隨著發(fā)酵劑添加量的增加出現(xiàn)先增大后降低的變化情況，在4%時感官評分達到最大。這是由于接種量不足，菌體生長達到高峰時間延長，培養(yǎng)基利用率低，產物合成滯后，接種量過大會使菌體生長加快，培養(yǎng)基黏度增加，影響產物合成，從而影響產品質量。故選取3%，4%和5%為響應面設計的三水平。

圖6 發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵試驗的影響

3.2.3 奶粉添加量的確定

奶粉可以提供氮源和少量乳糖，適當?shù)奶砑恿靠梢蕴岣甙l(fā)酵液品質。由圖7可知，感官評分隨著奶粉添加量的增加而上升，在添加量0.2%時感官評分達到最大，之后隨著奶粉添加量的增加，感官評分呈下降趨勢。過低的奶粉添加量不足維持乳酸菌的生長繁殖，過多的奶粉添加量會使發(fā)酵液發(fā)酵過度，產酸過量，產生不良氣味。選擇0.1%，0.2%和0.3%為響應面設計的水平。

圖7 奶粉添加量對發(fā)酵試驗的影響

3.2.4 響應面優(yōu)化黃精發(fā)酵工藝

根據(jù)發(fā)酵試驗單因素結果，選取發(fā)酵時間、脫脂奶粉添加量和發(fā)酵劑添加量為影響因素，以黃精發(fā)酵液的感官評分為響應值，設計響應面試驗，試驗設計及結果分析見表5，回歸模型方差分析結果見表6。

表5 發(fā)酵試驗設計及結果

由響應面試驗結果對各因素進行擬合，得到多元回歸方程：

感官評分=+81.20-2.75A-0.50B-4.00C-2.75AB-1.25AC+2.75BC-1.47A2-4.47B2-3.48C2

由表6可知，該模型方程p＜0.01，有極顯著性影響，失擬項p=0.070 6＞0.05，無顯著性，說明無失擬因素存在。由F檢驗可知，一次項中發(fā)酵時間（A）和脫脂奶粉添加量（C）的p＜0.01，表明這兩個因素對黃精發(fā)酵工藝的優(yōu)化具有十分顯著影響；交互項中發(fā)酵時間與發(fā)酵劑添加量（AB）、發(fā)酵劑添加量與脫脂乳粉添加量（BC）之間的交互項p＜0.05，說明這兩組交互項對黃精發(fā)酵工藝的感官優(yōu)化有顯著影響；在二次項中，發(fā)酵劑接種量的p＜0.01，表明發(fā)酵劑添加量對優(yōu)化發(fā)酵工藝有極顯著影響，脫脂奶粉添加量的p＜0.05，表明其對黃精發(fā)酵工藝的優(yōu)化具有顯著影響；其他因素p＞0.05，影響不顯著。

表6 回歸模型方差分析

3.2.5 響應面與等高線結果分析

當固定兩個因素時，黃精發(fā)酵液的感官評分隨著第三個因素的增加呈現(xiàn)先變大后變小的趨勢，曲面的頂點即為最優(yōu)因素條件，響應面的陡峭程度及等高線的形狀反映兩因素間交互作用的顯著性[22]。從圖8~圖10可以看出，發(fā)酵時間（A）與發(fā)酵劑量（B），發(fā)酵劑量（B）與奶粉添加量（C）這兩組交互作用對感官評分的影響顯著，而發(fā)酵時間（A）與奶粉添加量（C）的曲面相對平緩且對應等高線偏圓，說明AC項交互作用對黃精發(fā)酵液感官評分影響較小。

圖8 發(fā)酵時間與發(fā)酵劑添加量的響應面及等高線分析圖

圖9 發(fā)酵時間與奶粉添加量的響應面及等高線分析圖

圖10 發(fā)酵劑添加量與奶粉量的響應面及等高線分析圖

3.2.6 黃精發(fā)酵最佳工藝及驗證試驗

由響應面軟件分析得最優(yōu)工藝條件：發(fā)酵時間

12.31 h、發(fā)酵劑添加量4.08%、奶粉添加量0.16%，此次感官評分為83.121 6分。為了便于試驗操作，對各參數(shù)稍作調整：發(fā)酵時間12.5 h、發(fā)酵劑添加量4%、奶粉添加量0.2%。經(jīng)過3組驗證試驗，感官評分為83.6分，與理論預測值接近，說明經(jīng)優(yōu)化該發(fā)酵工藝具有可行性。

4 結論

通過正交試驗對黃精糖化工藝進行優(yōu)化，得到最佳糖化工藝條件：料液比1∶40（g/mL）、糖化酶添加量2%、糖化時間5 h，按此工藝可得到還原糖含量為22.46%的糖化液，原料利用率得到提高。通過響應面試驗對黃精發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵劑添加量4%、奶粉添加量0.2%、發(fā)酵時間12.5 h，按此工藝可得到組織均勻、澄清透亮、香味濃郁的黃精發(fā)酵液。