響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取魔芋多糖的工藝

朱丹*，麻秀萍，楊菁，郭江濤

貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（貴陽 550025）

魔芋（Amorphophallus konjac），別名天南星、蛇頭草、花蓮桿，是天南星科的多年生草本植物魔芋的球狀塊莖[1]。魔芋中含量最多的是以葡甘露聚糖為代表的多糖類物質(zhì)。魔芋多糖是一種復(fù)合型糖，是已知植物多糖中黏度最大的天然高分子多糖[2]。研究表明，魔芋多糖具有降血脂、降血糖[3-4]、抗衰老[5]、抗癌[6]、抗炎[7]等多種生物學(xué)功能，還具有獨(dú)特的水溶性、成膜性、增稠性和凝膠性[8]，近年來越來越受到食品保健、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、醫(yī)療環(huán)保等領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。因此，如何高效提取魔芋多糖，成為魔芋產(chǎn)品開發(fā)及提高產(chǎn)業(yè)競爭力的關(guān)鍵問題。微波輔助提取具有提取效率高、提取速度快、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[9]，在食品及中藥提取方面具有較高的應(yīng)用前景。試驗(yàn)采用微波輔助提取結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)魔芋多糖的提取工藝進(jìn)行考察，為魔芋多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用魔芋（市售）；娃哈哈飲用水；無水乙醇、濃硫酸、苯酚（分析純，川東化工）；D-無水葡萄糖對(duì)照品（200098-190602，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5900型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；PJ21C-AN微波爐（美的公司）；DRHH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；H11650-W型離心機(jī)（湘儀離心機(jī)有限公司）；FA2204N型電子天平（上海箐海儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取102.75 mg葡萄糖對(duì)照品，置于500 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容至刻度，搖勻，即得

0.205 5 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

1.3.2 魔芋中還原糖的去除

由于還原糖會(huì)干擾多糖的含量測(cè)定，因此需將魔芋中的還原糖去除。取干燥至恒重的魔芋粉末，稱取1 g置250 mL圓底燒瓶中，加入200 mL 65%乙醇[10]于微波中回流提取20 min，過濾，將濾渣揮干至恒重，除去還原糖。

1.3.3 魔芋多糖的提取工藝

將1.3.2的方法干燥至恒重的魔芋粉末，精密稱定1 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入250 mL蒸餾水于微波爐中420 W功率下回流提取35 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心20 min（2 000 r/min），合并上清液，即得魔芋多糖提取液樣品。

1.3.4 魔芋多糖含量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取0.20，0.30，0.40，0.50和0.60 mL對(duì)照品溶液置于具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)足2 mL，加1.00 mL 5%苯酚溶液，在室溫水浴中緩緩加入5 mL濃硫酸，振搖，冷卻至室溫，放入沸水浴35 min，取出流水冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對(duì)照，于490 nm測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 樣品中多糖的含量測(cè)定

精密移取0.5 mL 1.3.3小節(jié)的魔芋多糖提取液樣品置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密移取2 mL，加1.00 mL 5%苯酚溶液，在室溫水浴中緩緩加入5 mL濃硫酸，振搖，冷卻至室溫，放入沸水浴35 min，取出流水冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對(duì)照，于490 nm測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多糖提取率，按式（1）計(jì)算多糖提取率。

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；M為魔芋質(zhì)量，g。

1.3.5 提取條件單因素試驗(yàn)

以魔芋中總多糖的提取率為指標(biāo)，研究微波功率、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素對(duì)魔芋多糖提取率的影響。

1.3.5.1 微波功率對(duì)魔芋多糖提取率的影響

在固定料液比1∶150（g/mL）、提取時(shí)間30 min條件下，考察不同微波功率（140，280，42，560和700 W）對(duì)魔芋多糖提取率的影響。

1.3.5.2 提取時(shí)間對(duì)魔芋多糖提取率的影響

在固定微波功率420 W、料液比1∶150（g/mL）的條件下，考察不同提取時(shí)間（5，15，30，45和60 min）對(duì)魔芋多糖提取率的影響。

1.3.5.3 料液比對(duì)魔芋多糖提取率的影響

在固定微波功率420 W、提取時(shí)間30 min的條件下，考察不同料液比（1∶150，1∶175，1∶200，1∶225和1∶250 g/mL）對(duì)魔芋多糖提取率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，通過Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，分析魔芋多糖的最佳提取條件[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為A=0.035 27C+0.145 4（R2=0.996 0），結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度在5.138~15.413 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 魔芋多糖提取條件單因素試驗(yàn)

2.2.1 微波功率對(duì)魔芋多糖提取率的影響

由圖2可知，魔芋多糖提取率先隨微波功率升高而升高，微波功率達(dá)到420 W時(shí)，提取率最高。隨后微波功率繼續(xù)升高，提取率反而降低。這是由于微波功率較低時(shí)，小分子的物質(zhì)先被浸提出來，而大分子的多糖類物質(zhì)浸出較少，且速度較慢，隨著微波功率增大，多糖類物質(zhì)的浸出速度加快，浸出量增多；微波功率繼續(xù)增大，多糖的水解速度也增大，從而使得魔芋多糖的提取率降低。而且微波功率過大，易使溶液爆沸，增加操作難度[13]。所以，微波功率選擇420 W。

圖2 微波功率對(duì)提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)魔芋多糖提取率的影響

由圖3可知，魔芋多糖提取率隨著提取時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，提取時(shí)間30 min時(shí)，提取率最高。微波提取時(shí)間較短，多糖無法完全溶出，因而提取率較低，在30 min時(shí)提取率最高，繼續(xù)延長微波提取時(shí)間，提取率降低，可能是由于魔芋多糖在提取30 min后，已基本溶出，繼續(xù)延長微波提取時(shí)間反而加劇多糖分解[14]，使得提取率降低。所以，提取時(shí)間選擇30 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.3 料液比對(duì)魔芋多糖提取率的影響

由圖4可知，料液比1∶225（g/mL）時(shí)，提取率最大，繼續(xù)提高料液比，提取率略有下降。料液比較低時(shí)，由于魔芋多糖是可溶性多糖，導(dǎo)致溶液黏度較大，分子溶出的阻力較大，提取不完全，因此提取率較低。隨著料液比增加，提取率顯著上升。料液比繼續(xù)增加，而提取時(shí)間保持不變，相當(dāng)于增加微波能耗，因此提取率略有降低。所以，料液比選擇1∶225（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化魔芋多糖的提取工藝

2.3.1 因素水平的設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇微波功率、提取時(shí)間、料液比為自變量，魔芋多糖的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)表1中響應(yīng)面試驗(yàn)方案，設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果見表2，回歸方程方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析

從響應(yīng)面結(jié)果分析來看，該模型的p值小于0.000 1，說明該回歸模型具有顯著差異，失擬項(xiàng)p值大于0.05，表示該回歸模型影響極顯著，與試驗(yàn)擬合良好，可用于魔芋多糖的提取優(yōu)化[15]。在該模型中，自變量B、C、B2對(duì)魔芋多糖提取率的影響極顯著，說明提取時(shí)間和料液比對(duì)魔芋多糖的提取率影響大；自變量AC、BC、A2、C2對(duì)魔芋多糖提取率的影響顯著，說明微波功率和料液比的交互作用及提取時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)魔芋多糖的提取率影響較大。魔芋多糖的提取率符合二次回歸方程為Y=15.38-0.15A+2.32B+2.26C-0.34AB-1.10AC+0.91BC-1.49A2-2.23B2-1.52C2（R2=0.990 3）。

2.3.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面的分析，得出2個(gè)因素之間對(duì)魔芋多糖提取率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖5~圖7所示。

響應(yīng)曲面和等高線圖反映2個(gè)因素交互作用對(duì)魔芋多糖提取率的影響，響應(yīng)曲面越彎曲，表明影響越顯著；等高線圖形狀越接近橢圓形，表明影響越顯著。從圖5~圖7可以看出，AC與BC交互作用對(duì)魔芋多糖的提取率影響較為顯著，響應(yīng)曲面坡度較大，等高線呈橢圓形，與回歸方程方差分析結(jié)果一致。從魔芋多糖提取率的二次回歸方程可以看出，在A、B、C這3項(xiàng)中，對(duì)魔芋多糖提取率影響順序?yàn)锽＞C＞A。說明提取時(shí)間的影響最大，料液比次之，微波功率的影響最小。

圖5 微波功率和提取時(shí)間交互作用對(duì)提取率的影響

圖7 提取時(shí)間和料液比交互作用對(duì)提取率的影響

圖6 微波功率和料液比交互作用對(duì)提取率的影響

2.4 最佳提取條件驗(yàn)證

通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，使用Design Expert 8.0軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到微波輔助提取魔芋多糖的最佳工藝：微波功率350 W、提取時(shí)間34.2 min，料液比1∶250（g/mL）。在此條件下模型預(yù)測(cè)的提取率為17.66%。在此基礎(chǔ)上，考慮到實(shí)際工作中的可操作性，確定最后的提取工藝為微波功率420 W、提取時(shí)間35 min、料液比1∶250（g/mL）。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得魔芋多糖的提取率為17.35%，與模型預(yù)測(cè)值接近，無顯著差異，表明響應(yīng)面分析方法的模型選擇合適，可用于確定最佳提取試驗(yàn)條件。

3 結(jié)論

魔芋多糖具有多種生物學(xué)活性及獨(dú)特性能，在食品、醫(yī)藥等各領(lǐng)域都有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)選用提取效率高、提取速度快的微波輔助提取法提取魔芋中的多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)提取率進(jìn)行回歸擬合，分析得出的最佳提取條件為微波功率420 W、提取時(shí)間35 min、料液比1∶250（g/mL）。在此試驗(yàn)條件下測(cè)得提取率為17.35%。試驗(yàn)為魔芋多糖的提取開發(fā)與利用提供一定理論基礎(chǔ)。