耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因分布特征及其機(jī)制探討

汪玉龍，周鵬鵬，郝維敏

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院，安徽 宿州 234000）

0 引言

肺炎克雷伯菌（KPN）屬革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌，常定植在住院患者的腸道和呼吸道內(nèi)，引起消化道、呼吸道、泌尿道、血液、顱內(nèi)、手術(shù)切口及皮膚軟組織等部位的感染，現(xiàn)已成為院內(nèi)感染重要的致病菌之一[1]。近年來廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的產(chǎn)生，導(dǎo)致KPN對一線、二線抗菌藥物及β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性不斷增加。2013年美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）報(bào)告顯示耐藥的淋球菌、耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌和艱難梭菌已成為目前對公眾健康威脅最大的3種細(xì)菌[2-3]。國內(nèi)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）于2007年由浙江大學(xué)學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道，此后十多年各地陸續(xù)出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，由CHINET和Mohnanarin全國細(xì)菌耐藥檢測結(jié)果可見，CRKP的檢出率由2011年的3.2%升至2015年的7.6%，2015年上海市CRKP檢出率更是達(dá)到20%。造成KPN對碳青霉烯類抗生素耐藥的因素較多，了解CRKP耐藥基因分布及其耐藥機(jī)制，通過脈沖場凝膠電泳進(jìn)行同源性分析以及MLST的細(xì)菌分型方法進(jìn)行流行病學(xué)分析進(jìn)一步了解該院情況，對解決細(xì)菌耐藥問題及指導(dǎo)臨床合理用藥及預(yù)防院內(nèi)流行爆發(fā)具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料。收集該院2019年1月至2020年12月臨床標(biāo)本分離得到的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌80株，去除重復(fù)株。質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌（ATCC 1705、ATCC 1706）和大腸埃希菌（ATCC 25922、ATCC 8739）均由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。陽性對照菌株KPC-2、TEM、NDM-1均來自該院檢驗(yàn)科。

1.2 主要儀器及試劑。MH平板、BP平板、MAC平板、VITEK 2 COMPACT自動微生物分析儀、革蘭陰性菌鑒定藥敏卡均購于法國梅里埃公司，PCR擴(kuò)增儀購于美國賽默飛公司 ，瓊脂糖及引物序列均由上海生工生物公司提供，DNA marker及Premix TaqTM均由日本TaKaRa公司提供，脈沖場凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)來自北京君益東方公司，藥敏紙片由英國Oxoid公司提供。

2 研究方法

2.1 藥敏測定。嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行分離培養(yǎng)所得臨床菌株并應(yīng)用VITEK 2 COMPACT自動微生物分析儀進(jìn)行菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)，同時(shí)用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行補(bǔ)充。結(jié)果判讀依照2020版CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀。

2.2 基因擴(kuò)增。提取待測菌株DNA，引物見表1，PCR擴(kuò)增體系為2×TaqPCRGreenMix（12.5 ul），模板（2.5 ul），上下游引物各1ul，DD H2O（8 ul），共25 ul的PCR反應(yīng)體系。按照查閱的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物放在凝膠成像儀中觀察記錄。

2.3 PFGE檢測。調(diào)待測菌懸液濃度在3.8個(gè)麥?zhǔn)宵c(diǎn)左右，加入1% Seakem Gold SDS膠制備膠塊，再用蛋白酶K進(jìn)行裂解消化，純水清洗2遍再用TE清洗4次每次15 min左右并進(jìn)行酶切孵育，按照參考文獻(xiàn)電泳條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將結(jié)果進(jìn)行聚類分析[4-5]。

2.4 MLST分型。查閱MLST分型資料得知肺炎克雷伯含有7個(gè)管家基因（gap、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB），并進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。最后將測序結(jié)果在肺炎克雷伯MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對確定序列型，詳情見表1。

表1 PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 菌株分布。80株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯標(biāo)本類型占比分別為：痰液45株（56.2%）、尿液12株（15%）、導(dǎo)管尖7株（8.7%）、引流液10株（12.5%）、血液6株（7.5%）。

3.2 藥敏結(jié)果。藥敏試驗(yàn)顯示，CRKP對阿米卡星敏感率為51.7%，對環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦等常見抗生素均具有較高耐藥率（＞70%），對頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢替坦及頭孢吡肟耐藥率為100%，詳見表2。

表2 80株菌株對常見抗生素藥敏情況

3.3 耐藥基因檢測結(jié)果。80株菌中檢測出有64株攜帶KPC-2基因（80%），4株攜帶NDM-1基因（5%），產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌有53株攜帶TEM基因（82.8%）,未發(fā)現(xiàn)新的基因亞型。部分電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分菌株KPC基因PCR擴(kuò)增電泳圖

3.4 PFGE分型結(jié)果。將80株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進(jìn)行脈沖場凝膠電泳，分析結(jié)果可把80株CRKP分為A1～A17不同帶型，其中A10帶型占比最多為16株，其次是A14為14株，每種帶型都包括1株到多株菌不等。在A10帶型中菌株16、77、50、36、75均來自該院ICU病房，可見存在一定的小范圍菌株流行情況，

3.5 MLST分型。PFGE聚類分析和MLST分析顯示產(chǎn)KPC-2型菌株主要為ST11型和ST395型，產(chǎn)NDM-1型菌株為ST263-F型和ST15-C型。ST11是主要型，占比81.3%（65/80）。其中ST526，ST45，ST395，只測得各1株，ST258，ST307檢測出3株。

4 討論

目前臨床應(yīng)用的所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中碳青霉烯類抗菌藥物抗菌活性最為廣泛，對產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的革蘭陰性菌具有較好的治療效果，是目前革蘭陰性菌治療效果最強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類藥物[6]。但隨著近年來藥物在臨床的應(yīng)用，細(xì)菌耐藥的相關(guān)逐漸增多。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：①碳青霉烯酶的產(chǎn)生，按照氨基酸序列的相似程度，可將其分為四類，A、B、D類碳青霉烯酶均具有水解碳青霉烯的活性，A類酶將導(dǎo)致細(xì)菌對頭孢菌素、青霉素、氨曲南和碳青霉烯類耐藥，腸桿菌科細(xì)菌中A類酶主要包括IMI、KPC及部分GES類型；B類酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶（即金屬酶），能夠水解除單酰胺環(huán)類外的全部β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，主要包括VIM、NDM及IMP；D類酶能夠水解氯唑西林和苯唑西林，多見于假單胞菌屬、不動桿菌屬及腸桿菌科，目前肺炎克雷伯菌中主要為OXA-48型[7-8]。②外膜孔蛋白的缺失或表達(dá)水平下降，革蘭陰性菌外膜的蛋白通道是抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌的重要途徑，膜孔蛋白能夠特異性導(dǎo)入β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，當(dāng)外膜孔蛋白缺失或表達(dá)水平下降時(shí)，導(dǎo)致其通透性改變，抗菌藥物無法進(jìn)入細(xì)菌發(fā)揮作用[9-10]。CRKP相關(guān)外膜孔蛋白主要包括OmpK35、OmpK36、OmpK37。OmpK35和OmpK36蛋白的缺失或表達(dá)水平的下降將導(dǎo)致細(xì)菌對抗菌藥物敏感性降低，OmpK37常處于休眠狀態(tài)，僅在OmpK35和OmpK36蛋白缺失時(shí)會上調(diào)表達(dá)水平，OmpK37高表達(dá)時(shí)碳青霉烯最低抑菌濃度將下降，OmpK37蛋白缺失或表達(dá)水平下降時(shí)，即出現(xiàn)細(xì)菌耐藥[11-12]。③靶位蛋白改變，青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）是β-內(nèi)酰胺類作用的靶點(diǎn)，PBPs結(jié)構(gòu)改變時(shí)與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力降低或不結(jié)合，對細(xì)胞壁合成粘肽的阻礙作用減弱或消失，對細(xì)菌細(xì)胞壁的破壞作用降低，出現(xiàn)耐藥[13-14]。目前研究主要發(fā)現(xiàn)PBP2位點(diǎn)減少或缺失，但不排除其他位點(diǎn)對碳青霉烯耐藥的影響，仍需進(jìn)一步研究[15]。④主動排外機(jī)制，細(xì)菌外排泵能主動將抗菌藥物排出至菌體外，導(dǎo)致菌體內(nèi)藥物濃度降低，產(chǎn)生耐藥性。AcrAB-TolC是肺炎克雷伯菌最主要的外排泵，有研究指出外排泵導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生與外膜通透性間具有一定關(guān)系，菌體主要外排抗菌藥物的速度超過藥物通過外膜孔蛋白進(jìn)入菌體的速度時(shí)將表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥，否則菌體仍對藥物敏感[16]。

CRKP對大多抗菌藥物耐藥，僅有少數(shù)抗菌藥物能夠發(fā)揮作用。本研究中80株CRKP對阿米卡星敏感率為51.72%，對環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦等常見抗生素均具有較高耐藥率（＞70%），對頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢替坦及頭孢吡肟耐藥率為100%，大大增加了臨床治療難度。本研究選取80株CRKP菌株，由此可見CRKP因攜帶不同碳青霉烯酶基因而呈現(xiàn)不同基因分型[17-18]。

因菌株的耐藥性，基因型及流行分布會因地域或時(shí)間不同而存在差異，此次研究對了解該院的情況有重要意義，從檢測的基因結(jié)果表明該院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌主要攜帶KPC-2基因，檢出率為80%，肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制最主要就是產(chǎn)KPC酶，以KPC-2為主，較國內(nèi)其他地區(qū)研究相似。接下來會進(jìn)一步從轉(zhuǎn)座子，質(zhì)粒介導(dǎo)等方面進(jìn)一步研究菌株耐藥基因的水平傳播，這也是引起院內(nèi)感染爆發(fā)的原因[19]。從同源性分析來看在A10帶型中菌株16、77、50、36、75均來自該院ICU病房，可見該院存在小部分流行爆發(fā)情況，應(yīng)引起該院重視采取合理有效地措施進(jìn)行防止菌株流行的延續(xù)。有研究表明產(chǎn)NDM 陰溝腸桿菌MLST主要為ST93型[20]。該院研究有2株攜帶TEM基因的菌株的分型分別為ST258，ST307，可見相同耐藥基因會有不同的分型，這也是耐藥機(jī)制的復(fù)雜性之一，也進(jìn)一步完善耐藥方面的研究。

綜上所述，耐藥基因在不同菌株、菌種及菌屬之間的傳遞，也造成了細(xì)菌耐藥性的播散，我們應(yīng)對碳青霉烯類耐藥情況密切關(guān)注，及時(shí)采取有效地控制措施，控制和減少院內(nèi)交叉感染的發(fā)生。