二代測序和熒光原位雜交在骨髓增生異常綜合征中的臨床價值

韓雪瑩，王曉南，王靜靜，張 暋

(鄭州金域臨床檢驗中心有限公司分子醫(yī)學(xué)實驗中心，河南 鄭州 450016)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS) 是一組起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性髓系克隆性疾病，該疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和治療與基因突變和染色體的異常有較大關(guān)系[1-3]。對MDS及疑似患者進(jìn)行分子鑒別診斷是一個重要的檢驗手段。本研究對鄭州金域臨床檢驗中心，同時送檢二代測序(next-generation sequencing，NGS)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)2種檢測方法的137例MDS標(biāo)本進(jìn)行分析，以評估2種檢測方法在MDS診斷、預(yù)后、治療中優(yōu)勢和臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料收集2019年5月至2020年3月同時進(jìn)行NGS MDS檢測套餐和FISH MDS四項檢測的MDS標(biāo)本137例，其中男64例、女73例，年齡40～80歲，中位年齡56歲。

1.2 方法

1.2.1 NGS實驗方法 提取乙二胺四乙酸抗凝血DNA，DNA總量滿足1 000 ng。DNA進(jìn)行酶切打斷，末端修復(fù)后加A尾和接頭。磁珠篩選后用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇純化，制備文庫。用設(shè)計好的MDS相關(guān)基因探針進(jìn)行文庫雜交，并對靶基因進(jìn)行捕獲上機。數(shù)據(jù)分析時，需先就測序質(zhì)量、同義突變、臨床證實為良性及人群突變頻率較高的位點進(jìn)行過濾。其余位點根據(jù)分級證據(jù)進(jìn)行臨床意義分級，Ⅰ類突變位點具有強臨床意義，Ⅱ類突變位點具有潛在臨床意,Ⅲ類突變臨床意義未明，Ⅳ類突變?yōu)榕R床意義良性或可能為良性的突變位點，并對分級位點進(jìn)行臨床注釋。

1.2.2 FISH實驗方法 吸取2 mL抗凝血，2 200 r/min，離心4 min棄上清，加8 mL氯化鉀進(jìn)行低滲處理；加8 mL 固定液固定(蛋白變性硬化，染色體形態(tài)固定下來)；加固定液滴片，56 ℃烤30～120 min看細(xì)胞數(shù)量；洗雜質(zhì)，加探針，75 ℃ 5 min，37 ℃ 18 h雜交；洗未結(jié)合的探針，加5 μL 125 ng/mL DAPI復(fù)染，最后進(jìn)行顯微鏡計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2種檢測方法的陽性率和發(fā)單周期比較對137例患者的NGS和FISH檢測結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NGS陽性患者93例，占比為67.88%(93/137)；FISH陽性患者30例，占比為21.90%(30/137)。FISA陽性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NGS，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=58.553,P<0.001)。且在44例NGS陰性患者中，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果有42例為陰性，2例為陽性。說明在NGS檢測為陰性的情況下，F(xiàn)ISH極少檢測到陽性，該情況下陽性檢出率為4.55%。這提示NGS技術(shù)在疾病的檢測過程中具有更高的陽性檢出率。對137例MDS標(biāo)本的發(fā)單周期(標(biāo)本接收至出具結(jié)果報告單的時間)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明FISH發(fā)單時間為3～4 d，而NGS發(fā)單時間為9 d。

2.2 FISH檢測陽性患者中的NGS基因突變類型分析結(jié)果對30例FISH檢測陽性患者進(jìn)行基因突變譜分析，結(jié)果表明檢測到5q-的患者10例，其中8例合并有TP53基因突變。除5q-外，我們統(tǒng)計了檢測到7q-患者共6例，基因突變譜(患者可存在多基因突變)為ASXL1 2例，TP53 2例、DNMT3A 2例、IDH1 1例、NRAS 1例、SETBP1 2例、EZH2 1例、ETV6 例、TET2 1例。FISH檢測到20q-患者共9例，其中基因檢測結(jié)果為ASXL1 2例，U2AF1 3例，TP53 4例，DNMT3A 1例，TET2 1例，GNAS 1例，BCOR 1例。FISH檢測到+8患者有8例，其中合并的突變基因為ASXL1 3例、RUNX1、U2AF1、TP53 各2例，ETV6、PTPN11、PHF6、NRAS 各1例。見圖1。

圖1 FISH檢測陽性患者中的NGS基因突變譜

2.3 FISH檢測陰性患者中NGS陽性患者基因突變檢出率我們針對FISH陰性患者中ASXL1、TET2、TP53、RUNX1、DNMT3A、EZH2、SF3B1的檢出率進(jìn)行了統(tǒng)計。分析結(jié)果表明：107例FISH檢測陰性患者中，檢測到含有以上7種基因突變患者共58例，F(xiàn)ISH 檢測陰性中NGS陽性檢出率高達(dá)54.21%。其中58例患者中檢測到的基因突變ASXL1 25例(23.36%)、TET2 16例(14.95%)、TP53 3例(2.80%)、RUNX1 5例(4.67%)、DNMT3A 17例(15.89%)、EZH2 5例(4.67%)，SF3B1 7例(6.54%)。進(jìn)一步收集鄭州金域臨床檢驗中心2018年1月至2020年12月NGS中MDS檢測陽性2 082例，對7種基因的突變頻次進(jìn)行統(tǒng)計，比較FISH檢測陰性NGS陽性患者和2 082例NGS陽性患者中7種基因突變頻率的差異。2組TP53基因突變檢出頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.273,P=0.022)。2 082例TP53突變基因檢出頻率是FISH陰性NGS陽性患者的3.33倍，原因可能是TP53主要出現(xiàn)在FISH檢測到5q-陽性標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測陰性標(biāo)本中TP53的陽性檢出率大大降低，造成該數(shù)值偏小。見表1。

表1 7種基因在FISH陰性患者及2 082例NGS陽性患者中的突變頻率比較

2.4 陽性檢測結(jié)果在137例MDS中的分布情況我們比較了MDS患者及疑似患者中基因突變及細(xì)胞遺傳學(xué)異常在性別年齡中的分布情況。在137例患者中，女性患者比例高于男性患者。但是男性NGS結(jié)果發(fā)生基因突變的頻率要高于女性。從發(fā)病年齡上可以看出MDS發(fā)病人群主要集中在40～80歲(中位年齡56歲)。NGS檢測結(jié)果顯示，發(fā)病30歲以上人群發(fā)生基因突變的頻率較高，61～90歲(中位年齡72歲)的患者被檢測到突變的次數(shù)最高，說明突變的發(fā)生和年齡有較大的關(guān)系。FISH檢測結(jié)果表明40～70歲(中位年齡55歲)的患者具有較高的陽性檢出率，且51～60歲(中位年齡55歲)的陽性率最高。對NGS和FISH 2種檢測方法陽性占比進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在41～70歲(中位年齡55歲)的患者中，檢測到基因突變和細(xì)胞遺傳學(xué)異常的概率較大。見表2。

表2 陽性檢測結(jié)果在人群中的分布 n(%)

3 討論

目前MDS的診斷和治療依靠各種實驗室檢測技術(shù)的綜合應(yīng)用，除了傳統(tǒng)的細(xì)胞形態(tài)、流式技術(shù)等，分子診斷技術(shù)被廣泛運用于臨床。MDS中國診斷與治療指南中也將熒光原位雜交技術(shù)及基因突變檢測列為MDS的主要診斷技術(shù)，為MDS的精準(zhǔn)診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。因此本研究對NGS和FISH在MDS中的臨床價值進(jìn)行了分析。

本研究對137例同時進(jìn)行NGS和FISH等2種檢測方法的患者進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表明NGS陽性檢出率為67.88%，F(xiàn)ISH陽性檢出率為21.90%，說明NGS在陽性檢出率方面具有更大的優(yōu)勢。在137例患者中，NGS技術(shù)共檢測到44例陰性，且在NGS為陰性的患者中僅有2例出現(xiàn)FISH陽性結(jié)果，表明NGS結(jié)果為陰性時，F(xiàn)HIS MDS四項為陽性的可能性較小，只有4.55%的概率。但是FISH檢測周期短、發(fā)單周期快，可為臨床獲得更快的治療時機。因此對疑似MDS者，無法進(jìn)行核型分析(骨髓干抽、無中期分裂相、分裂相質(zhì)量差或可分析中期分裂相<20個)時，可以選擇FISH檢測技術(shù)為臨床更快提供預(yù)后評估及治療方案。在30例FISH 陽性病例中，統(tǒng)計了檢測到5q-、7q-、20q-、+8陽性患者中基因的突變情況，分析結(jié)果表明在檢測到5q-時，TP53發(fā)生強臨床意義突變(Ⅰ類突變)的可能性較高，如果臨床上單獨做FISH而沒有進(jìn)行基因突變檢測，對臨床的預(yù)后判定和用藥都會產(chǎn)生重大的影響，因為TP53基因突變的出現(xiàn)會改變5q-患者預(yù)后較好及對來那度胺有效的臨床反應(yīng)[4-6]。目前針對MDS的分子研究受到了臨床的普遍重視，ASXL1、TET2、TP53、RUNX1、DNMT3A、EZH2、SF3B1等基因加入了診斷和預(yù)后的評估標(biāo)本中[7-9]。因此本研究對107例FISH陰性患者的基因突變情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)僅針對這7個基因的陽性檢出率就高達(dá)54.21%。其中7種基因在FISH陰性患者中的陽性率分別為ASXL1 23.36%、TET2 14.95%、TP53 2.80%、RUNX1 4.67%、DNMT3A 15.89%、EZH2 4.67%、SF3B1 6.54%。對比正常的NGS大群體突變頻率發(fā)現(xiàn)TP53的檢出率降低，再次證實TP53主要出現(xiàn)在FISH 5q-陽性標(biāo)本中，因此在FISH陰性標(biāo)本中TP53的陽性檢出率較低。陽性檢測結(jié)果在MDS人群中的分布情況表明，在137例MDS患者中女性患者偏多，但是男性患者NGS陽性檢出率較高，更易發(fā)生基因突變。137例患者的發(fā)病年齡主要集中在40～80歲(中位年齡65歲)，發(fā)病率隨年齡呈現(xiàn)上升趨勢。且30歲以上人群發(fā)生基因突變的頻率較高，61～90歲(中位年齡72歲)的患者尤甚，說明突變的發(fā)生和年齡有一定的相關(guān)性，不排除和免疫力、腫瘤細(xì)胞清除、錯配修復(fù)能力降低及突變積累相關(guān)[10-11]。40～70歲(中位年齡55歲)的患者更易檢測到FISH陽性結(jié)果，且51～60歲(中位年齡55歲)的陽性率最高。41～70歲(中位年齡55歲)的患者中，檢測到基因突變和細(xì)胞遺傳學(xué)異常的概率較大，同時檢測出NGS和FISH雙陽性結(jié)果。

在臨床檢驗中，任一單一的分子診斷技術(shù)都不能夠確立MDS診斷，對于基因突變在MDS診斷中的價值應(yīng)結(jié)合其他指標(biāo)審慎判斷。NGS和FISH在臨床檢測中都有自己的優(yōu)勢和臨床輔助診斷價值，NGS通量高，可以檢測未知的位點，但檢測不到大片段的缺失重復(fù)且發(fā)單時間較長。盡管FISH具有較高的陰性率以及與疾病密切相關(guān)分子的漏檢率，但可以在技術(shù)上彌補NGS的缺陷，可檢測常見的大片段擴增、缺失及基因重排等，是一種檢測結(jié)果的補充，不能被取代。針對本研究的分析結(jié)果，患者在檢測到5q-時一定要參照NGS結(jié)果進(jìn)行臨床治療方案的確定。在核型沒有遺傳學(xué)變異的情況下，建議MDS特別是年齡在41～70歲(中位年齡55歲)之間易產(chǎn)生檢測雙陽性的患者進(jìn)行FISH和NGS聯(lián)合檢測，為臨床提供更全面精準(zhǔn)的評估和治療指導(dǎo)。