苦參堿對番茄根際土壤微生態(tài)的影響

華羚淇 ，寧靜，曾紅*

（1塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

果類蔬菜中的番茄（Lycopersicon esculeutumMill），不僅外形美觀，味道鮮美，而且富含多種維生素、礦物質(zhì)和酚類化合物，是良好的保健食品，對疾病也有一定的預防功效，具有很高的商品、風味與營養(yǎng)價值，已經(jīng)成為人們生活中必不可少的蔬菜之一，有廣闊的市場前景。近年來，番茄的種植面積在不斷增加，但其優(yōu)質(zhì)化進程嚴重制約著我國農(nóng)產(chǎn)品價值的進一步提升，而通過合理的施肥等方法來改善番茄的品質(zhì)是目前研究的重點之一。

糖的含量是影響番茄果實風味品質(zhì)的重要指標，也是消費者評判番茄好壞的重要標準。番茄果實中糖分含量的多少與番茄光合物質(zhì)合成、運轉(zhuǎn)和代謝密切相關(guān)。植物光合產(chǎn)物運轉(zhuǎn)的主要形式是蔗糖，其首先由葉片等“源”器官經(jīng)光合作用產(chǎn)生，經(jīng)過一系列復雜的運輸過程，最終進入果實，在果實內(nèi)還會進行一系列的生化反應(yīng)，最終形成果實內(nèi)的總糖。因此葉綠素的含量與果實的糖分累積密切相關(guān)，合理地施用肥料對番茄果實的糖含量有著至關(guān)重要的影響。

苦豆子是中國西北地區(qū)常見的植物，廣泛分布于新疆地區(qū)，當?shù)胤N植者在種植作物如甜瓜、西瓜時，常將苦豆子地上部分作為綠肥施用于作物根際，實現(xiàn)果實增甜的效果?？喽棺雍卸喾N生物堿，苦參堿是其主要成分之一。在過往農(nóng)業(yè)相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)苦參堿具有殺蚜活性，經(jīng)苦參堿處理后的豆蚜代謝酶系受到顯著影響，且苦參堿干擾了蟲體對堿的代謝[1]；在針對亞洲柑橘木虱的實驗中，苦參堿表現(xiàn)出對木虱發(fā)現(xiàn)和選擇寄主能力的干擾效果，有效減少了柑橘植株所受侵害[2]。而在番茄植株的研究中，苦參堿的施用提高了番茄第一穗果實的單果重量，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[3]。

基于以上考慮，本試驗研究在生長期、花期和果實成熟時期苦參堿對番茄葉片葉綠素含量的影響，并從植物根際土壤理化性質(zhì)、酶活性及根際微生物群落結(jié)構(gòu)等角度對番茄在根際微生態(tài)層面的動態(tài)變化進行分析，以期為番茄增甜種植提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄：品種為紫玉，種子購自山東壽光種業(yè)有限公司?？鄥A：純度＞95%，由塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室提供。

1.2 實驗方法

2020年，在新疆阿拉爾市塔里木大學塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室植物組織培養(yǎng)室（40°32′46″N，81°17′20″E）進行了盆栽試驗。實驗設(shè)空白對照組（CK）、苦參堿處理組（0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL）。2020年9月2日，開始育種，12月25日進入花期，花期進行人工授粉；2021年1月5日坐果。所有的實驗地點均沒有使用化肥和除草劑等化學藥劑。在植株進入生長期，于12月2日后，開始分組處理。將對照組和實驗組分別用清水和苦參堿進行灌根處理。灌根法：將清水或不同濃度的苦參堿10 mL分別加入相應(yīng)處理組的番茄植物根部。每隔7 d加一次樣，共加3次。1.2.1 土壤樣品的采集

分別于2020年12月2日（生長期）、2020年12月30日（花期）和2021年1月7日（坐果后）采集根際土壤樣品。用力晃動番茄植株根部，以除去根周圍的松散土壤，再用小刷子小心地收集黏附在根部表面的土壤，以獲得根際土壤。使用混樣法，每個分組隨機選取三個平行樣品，并混合樣品。采樣后立刻將根際土壤樣本放入冰盒，并迅速轉(zhuǎn)運至實驗室，通過60目篩除去植物殘余和土壤動物。每個樣品分為兩部分：一部分在-80℃下保存，用于測定微生物群落多樣性；另一部分室溫風干以測定土壤理化性質(zhì)和酶活性。

1.2.2 番茄根際土壤酶活性和理化性質(zhì)的測定

采用碳酸氫鈉法測定土壤有效磷（available phosphorus，AP）含量，將0.5 mol/L NaHCO3溶液以1：20的比例在25°C下以180 r/min振蕩30 min，從土壤樣品中提取土壤有效磷，通過定性脫磷濾紙過濾提取液并使用鉬銻抗比色法分析有效磷含量[4]；使用火焰分光光度法測定土壤樣品中鉀離子（total K+，TK）的含量，將1 mol/L CH3COONH4以1：10的土壤溶液比從樣品中提取土壤鉀離子，樣品在20°C下以180 r/min振蕩30 min，提取液通過定性濾紙過濾，并使用火焰光度計（philes，中國南京）分析鉀含量。土壤樣品的氮（total nitrogen，TN）含量使用從蘇州科銘生物技術(shù)有限公司（中國）購買的商業(yè)試劑盒測定，測定方法為凱氏法，先用高錳酸鉀將樣品中的亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮后，再用還原鐵粉使全部硝態(tài)氮還原，轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，將樣品用濃硫酸消煮，使有機氮分解為銨態(tài)氮。堿化后蒸餾出來的氨用硼酸吸收，以酸標準溶液滴定，分析土壤全氮含量。

土壤酶活性試劑盒購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司（中國）。以酪蛋白為底物測定堿性蛋白酶（alkaline protease，ALPT）活性。以酚酞磷酸鹽為底物測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性。用靛酚藍比色法測定脲酶（urease，UE）活性。在好氧條件下，以單酚和雙酚氧化制醌為基礎(chǔ)，測定了多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性。用比色法測定蔗糖酶（sucrase，SC）活性。H2O2在 240 nm 下有特征吸收峰，通過測定與土壤反應(yīng)后溶液在此波長下吸光度的變化，即可反應(yīng)過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的高低。

1.2.3 根際微生物多樣性

用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取基因組DNA。隨后，使用量子熒光計和納米滴分光光度計測定DNA濃度、質(zhì)量和完整性。使用TruSeq DNA樣品制備試劑盒和模板制備試劑盒生成測序文庫?；蚪M測序由個人生物技術(shù)公司（中國上海）使用Pacific Biosciences平臺和Illumina MiSeq平臺進行。

序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME和R軟件包（v3.3.0）進行。用qime中的OTU表對OTU水平的a多樣性指數(shù)進行計算，如Chao1豐富度估計器、ACE度量（豐度覆蓋估計器）、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson指數(shù)。生成OTU水平排序豐度曲線，比較樣品間OTU的豐富度和均勻度。利用UniFrac距離度量[5-6]和主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）進行β多樣性分析，以研究樣本間微生物群落的結(jié)構(gòu)變化，非度量多維標度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和算術(shù)平均無權(quán)對群方法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）分層聚類[7]。使用Student t檢驗和1000個排列的蒙特卡羅排列檢驗確定組間成對比較的Unifrac距離差異，并通過方框圖和胡須圖進行可視化。主成分分析（principal components analysis，PCA）也根據(jù)屬級成分剖面進行[7]。使用排列多變量方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）[8]、相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）[9-10]和R軟件包“vegan”評估各組間微生物群結(jié)構(gòu)分化的顯著性。使用MEGAN[11]和GraPhlAn[12]對分類組成和豐度進行可視化?；跇悠?組間OTU的發(fā)生率（無論其相對豐度如何），使用R軟件包“VennDiagram”生成了Venn圖，以可視化樣品或組間共享和獨特的OTU[13]。

在門、綱、目、科、屬和種水平上的分類單元豐度通過Metastats在樣本或組之間進行統(tǒng)計比較[14]。使用默認參數(shù)的線性判別分析效應(yīng)大小（LEfSe）分析檢測組間差異豐富的分類群[15]。利用PLS-DA中R軟件包“混合組學”的“plsda”功能揭示組間微生物群的變化[16]。隨機森林分析應(yīng)用于區(qū)分來自不同群體的樣本，使用 R 軟件包“randomForest”分析[17-18]。采用10倍交叉驗證法估計泛化誤差，預期的“基線”誤差也包括在內(nèi)。通過計算優(yōu)勢類群之間的Spearman秩相關(guān)進行共現(xiàn)分析。使用Cytoscape將|RHO|＞0.6和P＜0.01的相關(guān)性可視化為共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)[19]。微生物功能由軟件PICRUSt根據(jù)高質(zhì)量序列進行預測[20]。

1.3 統(tǒng)計分析

本研究中單個樣本的所有數(shù)據(jù)均表示為三個獨立實驗值的平均值±標準差。使用SPSS 18.0.0軟件進行單因素方差分析，檢驗多組數(shù)據(jù)的平均值。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為更顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿處理后番茄葉片的葉綠素含量及糖含量變化

如圖1結(jié)果所示，在花期時，番茄葉片CK組的葉綠素含量為0.3560 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉綠素含量為0.3682 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉綠素含量為0.4935 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉綠素含量為0.4329 mg/g。

坐果后，番茄葉片CK組的葉綠素含量為0.5284 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉綠素含量為0.8059 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉綠素含量為0.5017 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉綠素含量為0.9432 mg/g。

圖1 番茄葉片中的葉綠素含量

如圖2結(jié)果所示，在花期時，番茄葉片CK組的葉片糖含量為3.8510 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉片糖含量為3.9792 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉片糖含量為1.3990 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉片糖含量為2.7772 mg/g。

圖2 番茄葉片中的可溶性糖含量

坐果后，番茄葉片CK組的葉片糖含量為1.1518 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉片糖含量為5.4226 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉片糖含量為3.6369 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉片糖含量為1.5863 mg/g。

2.2 苦參堿處理后番茄植株根際土壤的理化性質(zhì)與酶活性

如圖3結(jié)果所示，在坐果后，施用苦參堿的處理組的根際土壤的氮含量顯著高于空白對照組。

圖3 番茄根際土壤理化性質(zhì)

相比CK組，苦參堿處理后的番茄根際土壤的多酚氧化酶、脲酶的活性均有顯著提高（如圖4結(jié)果所示）。

圖4 番茄根際土壤酶活性

2.3 施用苦參堿對番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 微生物群落的α多樣性的影響

通過測序從根際細菌群落獲得平均130249個原始序列；使用DADA2方法處理這些序列。剔除低質(zhì)量序列后共獲得109302個序列，去噪后獲得101313個有效序列，拼接后獲得61308個序列，剔除嵌合體后獲得51250個高質(zhì)量序列，去除singleton后，最后獲得48263個序列。

對根際真菌群落進行測序，平均獲得139625個原始序列。剔除低質(zhì)量序列后共獲得118459個序列，去噪后獲得117714個有效序列，拼接后獲得116145個序列，剔除嵌合體序列后獲得112799個高質(zhì)量序列，剔除單基因序列后獲得112799個序列。

對于番茄根際細菌群落的α多樣性，在苦參堿處理后番茄植株根際細菌群落的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于CK組，表明施用苦參堿后根際細菌群落的豐富度和多樣性有明顯提升（圖5）。

圖5 番茄植物根際細菌α多樣性分析

對于番茄根際真菌群落的α多樣性，在苦參堿處理后番茄植株根際真菌群落的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高于CK組，表明施用苦參堿后，根際真菌群落的豐富度和多樣性增加（圖6）。

圖6 番茄植物根際真菌α多樣性分析

豐度曲線根據(jù)每個樣品/組的豐度大小沿橫坐標排列操作分類單位（OTU），并將其各自的豐度值作為縱坐標。各OTU之間以折線或曲線連接，反映了OTU豐度在各樣品中的分布規(guī)律。對于微生物群落樣品，該曲線能直觀地反映群落中稀有OTU的高豐度和數(shù)量（圖7）。施用苦參堿的處理組的等級普遍高于對照組，這表明苦參堿處理組群落中高豐度和稀有OTU的數(shù)量高于對照組。

圖7 根際微生物群落的豐度曲線

2.3.2 主坐標分析（PCoA）和非度量多維標度分析（NMDS）

NMDS用于評估經(jīng)苦參堿處理的番茄植株根際的微生物群落結(jié)構(gòu)。在番茄開花期，細菌群落結(jié)構(gòu)如圖8（a）所示；應(yīng)力為0.0349。真菌群落結(jié)構(gòu)如圖8（b）所示；應(yīng)力為0.0554。細菌和真菌NMDS圖中的應(yīng)力值均小于0.2，說明數(shù)據(jù)是有效的。采用PCoA法對番茄根際微生物群落功能進行了評價。番茄根際細菌群落功能的PCoA如圖8（c）所示，其中用PCo1和PCo2解釋的百分比分別為71.6%和14.4%。圖8（d）顯示了番茄根際真菌群落功能的PCoA，其中PCo1和PCo2解釋的方差百分比分別為52.0%和21.5%。

圖8 開花期番茄根際微生物群落的NMDS分析和功能單元的PCoA分析

在番茄果實成熟期，細菌群落結(jié)構(gòu)如圖9（a）所示；應(yīng)力為0.0334。真菌群落結(jié)構(gòu)如圖9（b）所示；應(yīng)力為0.0783。細菌和真菌NMDS圖中的應(yīng)力值均小于0.2，說明數(shù)據(jù)是有效的。采用PCoA法對甜瓜根際微生物群落功能進行了評價。番茄根際細菌群落功能的PCoA如圖9（c）所示，其中用PCo1和PCo2解釋的百分比分別為73.5%和15.5%。圖9（d）顯示了番茄根際真菌群落功能的PCoA，其中PCo1和PCo2解釋的方差百分比分別為83.4%和9.4%。

圖9 成熟期番茄根際微生物群落的NMDS分析和功能單元的PCoA分析

2.3.3 冗余分析

以番茄葉片的葉綠素含量為指標，以番茄在各生育時期根際土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性和根際微生物優(yōu)勢菌群為因子，進行了冗余分析（redundancy analysis，RDA），以尋找與葉綠素含量存在相關(guān)性的因子。結(jié)果表明，在番茄開花期（圖10）與果實成熟期（圖11），根際細菌Aeromicrobium、Aliihoeflea、Blastococcus、Lysobacter、Nocardioides、Pelagibacterium和Salinimicrobium的相對豐度與葉片的葉綠素含量呈正相關(guān)。對于真菌，Acaulium的相對豐度與含糖量呈正相關(guān)。土壤理化性質(zhì)如氮含量和有效鉀含量與葉綠素含量呈正相關(guān)，土壤酶活性如多酚氧化酶、過氧化氫酶、堿性蛋白酶、堿性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性均與葉綠素含量呈正相關(guān)。

圖10 開花期根際樣品葉綠素含量、土壤酶活性、理化性質(zhì)和優(yōu)勢微生物屬的RDA分析

3 討論

葉綠素含量是評價植株生理的重要指標。在番茄花期，施用苦參堿濃度為0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL的處理組的植株葉綠素含量分別比對照組高3.41%、38.60%、21.58%；在成熟期，苦參堿0.0625 mg/mL和0.2500 mg/mL組的葉綠素含量分別比對照組高52.53%、78.52%這表明施用苦參堿可以有效地提高番茄葉片的葉綠素含量。

在施用苦參堿后，番茄根際土壤酶如多酚氧化酶、脲酶和蔗糖酶的活性均有顯著提升，說明植物吸收營養(yǎng)素及抗逆的能力得到了提升。

施用苦參堿后，番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。NMDS圖顯示，苦參堿處理組與對照組的距離較遠，說明苦參堿處理組和CK組的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。此外苦參堿0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL的處理組與CK組的距離依次增大，表明群落結(jié)構(gòu)的改變程度與苦參堿的濃度及用量呈正相關(guān)。

功能單元PCoA圖顯示苦參堿處理組與CK組的距離較遠，說明苦參堿處理組與CK組的微生物群落功能存在顯著差異。此外苦參堿0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL處理組與CK組的距離依次增大，表明群落功能的改變程度與苦參堿的濃度及用量呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，苦參堿可以改變番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。

通過對比屬分類學水平下，處理組中相對豐度顯著高于對照組的細菌種群，與RDA分析中與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的細菌種群，發(fā)現(xiàn)Aeromicrobium、Altererythrobacter、Erythrobacter、Hyphomicrobium、Pedomicrobium、Steroidobacter、Streptomyces和Lysobacter是番茄花期（t2）與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對豐度顯著上升的細菌；而Ilumatobacter、Nocardioides和Lysobacter是番茄成熟期（t3）與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對豐度顯著上升的細菌。

同樣的，通過對比屬分類學水平下，處理組中相對豐度顯著高于對照組的真菌種群，與RDA分析中番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的真菌種群，發(fā)現(xiàn)Arthrographis、Byssochlamys、Exophiala、Lophotrichus、Microascus、Paecilomyces、Petriella、Pleurostoma、Scedosporium和Schizophyllum是番茄花期與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對豐度顯著上升的真菌；而Preussia和Talaromyces是番茄成熟期與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對豐度顯著上升的真菌。

4 結(jié)論

在番茄的盆栽實驗中驗證了苦參堿的效果，施用苦參堿后番茄葉片的葉綠素含量有較顯著提升，并改變了番茄根際的微生物群落結(jié)構(gòu)，如Streptomyces和Lysobacter等有益菌種豐度顯著提升，改善了植株根際的微生態(tài)，促進植株的生長，具有良好的應(yīng)用前景。