NLRP3炎癥小體在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的作用及中藥干預(yù)研究進(jìn)展

史悅悅 張曉熙 楚秉泉 夏道宗

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是一種由嘌呤代謝紊亂所引起的代謝性疾病，其特征是尿酸來(lái)源增多或去路減少，造成體內(nèi)尿酸代謝失衡，過多尿酸鹽以晶體形式沉積在關(guān)節(jié)囊、軟骨等部位，刺激炎癥產(chǎn)生[1]。GA的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量及工作效率[2]。針對(duì)痛風(fēng)，西醫(yī)多采用抗炎藥物或降尿酸藥物治療，具有較好療效，但停藥后易復(fù)發(fā)，且存在較多不良反應(yīng)，如秋水仙堿易引起胃腸道反應(yīng)、別嘌呤醇易引起皮疹等過敏反應(yīng)[3]。中醫(yī)中藥治療痛風(fēng)多以脾虛濕熱瘀阻為辨證要點(diǎn)，通過清除患者體內(nèi)的濕、熱、瘀、毒之邪，并調(diào)和機(jī)體臟腑陰陽(yáng)，達(dá)到協(xié)同治療的效果。相較于西藥，中藥治療從整體出發(fā)，通過辨證論治，對(duì)于復(fù)雜的病情判斷較為準(zhǔn)確，臨床療效更為突出，在控制病情發(fā)展、降低不良反應(yīng)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此，中藥很可能成為未來(lái)抗痛風(fēng)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[4]。

Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體又稱Cryopyrin，最早在Muckle-Wells自身炎癥性疾病綜合征中被發(fā)現(xiàn)[5]?，F(xiàn)已證明，NLRP3炎癥小體是許多疾病的重要治療分子靶點(diǎn)，在肺損傷[6]、心血管疾病[7]、帕金森綜合征[8]及GA[9]的治療研究中具有重要地位。NLRP3炎癥小體由NLRP3支架、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和效應(yīng)蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1） 三部分組成。作為固有免疫的重要組成部分，NLRP3炎癥小體的激活和白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）的釋放在痛風(fēng)進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。本文基于NLRP3炎癥小體在GA中的作用，擬對(duì)中藥復(fù)方、單味中藥提取物、中藥單體化合物治療GA的研究進(jìn)行系統(tǒng)梳理，以期為GA治療藥物的研發(fā)提供參考。

1 NLPR3炎癥小體與GA的關(guān)系

GA是一種自身炎癥性疾病，當(dāng)血尿酸濃度過高時(shí)，尿酸以鈉鹽的形式沉積在關(guān)節(jié)中，引起組織異物炎性反應(yīng)，因此先天免疫反應(yīng)是GA組織破壞和炎癥反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力。2006年，Martinon等首次報(bào)道了尿酸鈉（monosodium urate，MSU）晶體能夠刺激NLRP3炎癥小體的激活，促進(jìn)IL-1β的成熟活化[10]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，GA患者關(guān)節(jié)滑膜中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)增高[9，11-12]。 GA模型小鼠的關(guān)節(jié)勻漿中，NLRP3炎癥小體、核因子-κB/p65（nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65） 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的蛋白表達(dá)也明顯增加，NLRP3、ASC和caspase-1基因敲除小鼠則無(wú)法在MSU晶體誘導(dǎo)下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[13]。以上都提示，NLRP3炎癥小體的激活與GA密切相關(guān)?；贜LRP3炎癥小體，現(xiàn)階段研究所涉及的中藥干預(yù)機(jī)制主要包括：影響活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，抑制NLPR3支架激活，抑制ASC斑點(diǎn)的形成，抑制NLRP3炎癥小體的組裝，負(fù)反饋調(diào)節(jié)炎癥因子產(chǎn)生以及抑制NF-κB對(duì)NLRP3炎癥小體的激活。MSU激活NLRP3炎癥小體，進(jìn)一步誘發(fā)GA的病理機(jī)制見圖1。

圖1 MSU激活NLRP3炎癥小體誘發(fā)GA的病理機(jī)制

2 中藥干預(yù)NLRP3炎癥小體抗GA的研究進(jìn)展

目前中醫(yī)將GA歸為“痹證”，其臨床用藥多以清熱化濕健脾及補(bǔ)虛為核心，兼顧活血化瘀、利濕除痹。中藥包括復(fù)方、單味藥提取物、單體活性成分，在GA治療中表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。在檢索的80篇中英文文獻(xiàn)中，治療GA的中藥藥性多為寒性，藥味為甘，主歸脾、胃、腎經(jīng)?；贜LRP3炎癥小體治療GA的相關(guān)中藥可分為以下幾大類：（1）清熱藥：土茯苓、知母、黃連、青蒿、冬凌草、綠茶、子菜；（2）利水滲濕藥：薏苡仁、茯苓、虎杖、菊苣；（3）化濕藥：蒼術(shù)、防己；（4）補(bǔ)虛藥：白術(shù)、黃芪、白芍；（5）活血化瘀藥：牛膝；（6）瀉下藥：大黃；（7）解表藥：桂枝、生姜、野菊花。了解中藥的性狀歸類，對(duì)未來(lái)靶向藥物及其他新藥的研究中具有重要意義。

2.1 中藥復(fù)方 臨床上治療GA的復(fù)方數(shù)量眾多，多在四妙散、當(dāng)歸拈痛湯、萆薢滲濕湯、宣痹湯、桂枝芍藥知母湯、桂枝白虎湯、獨(dú)活寄生湯和五味消毒飲等基礎(chǔ)上加減而成[14]。獨(dú)活寄生湯是治療GA的傳統(tǒng)方劑，療效顯著，該方中幾種化合物甘草酸、茯苓酸、龍膽堿和芍藥苷起主要作用[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，清熱除痹湯、痹寧湯能抑制炎性產(chǎn)物IL-1β的表達(dá)，可有效提升療效，降低全身炎癥反應(yīng)，減輕疼痛[16-17]。加味黃芪桂枝五物湯由黃芪、桂枝、白芍、川芎、牛膝組成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能通過下調(diào)NLRP3表達(dá)，上調(diào)保護(hù)性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）表達(dá)，有效改善關(guān)節(jié)的腫脹度，說(shuō)明其作用機(jī)制與NLRP3炎癥小體相關(guān)[18]。知黃痛風(fēng)湯能夠通過增加β-抑制蛋白2（β-arrestin 2，ARRB2） 表達(dá)，抑制NLRP3炎癥小體生成，從而抑制炎癥因子IL-1β、IL-18的產(chǎn)生，減輕GA的癥狀[19]。另有研究表明，桂枝芍藥知母湯抗GA的作用機(jī)制可能與降低中性粒細(xì)胞NLRP3、ASC表達(dá)，抑制NF-κB活化及IL-1β分化成熟有關(guān)；此外還能夠增加caspase-12表達(dá)，負(fù)反饋抑制NLRP3炎性小體信號(hào)通路激活，發(fā)揮抗痛風(fēng)作用[20]。萆薜除痹湯能夠下調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）通路，抑制NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β蛋白和基因的表達(dá)，從而防治GA[21]。 研究表明，MSU和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）同時(shí)刺激THP-1細(xì)胞可模擬出GA體外細(xì)胞模型，加味三妙丸能明顯下調(diào)該模型NLRP3、ASC、caspase-1、髓樣分化因子88（marrow like differentiation factor 88，MyD88）、Toll樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）等蛋白的表達(dá)，且具有劑量依賴性，其機(jī)制與調(diào)控NLRP3炎性體軸和NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)[22-23]?，F(xiàn)階段已知中藥復(fù)方抗GA的研究中，NLRP3炎癥小體的相關(guān)上游信號(hào)通路受到影響，但中藥復(fù)方是否能直接結(jié)合NLRP3炎癥小體，有待進(jìn)一步挖掘。

2.2 單味中藥提取物 與中藥復(fù)方相比，單味中藥成分相對(duì)清晰，對(duì)于中藥開發(fā)的進(jìn)一步研究有著重要的作用。單味中藥既可以單獨(dú)發(fā)揮療效，同時(shí)也可以與其他藥物協(xié)同產(chǎn)生效應(yīng)，因此單味藥研究是進(jìn)一步研究的重要基礎(chǔ)。比如，牛膝總皂苷能夠有效地緩解GA模型小鼠的活動(dòng)減少、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀[24]。白芍總苷、土三七提取物能夠降低GA小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，畬藥三腳風(fēng)爐水提物能夠調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體，抑制炎性因子IL-1β的表達(dá)[27]。GA模型小鼠活動(dòng)量減少，關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-6和IL-18水平顯著增高，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，滑膜組織中可見NLRP3、ASC、caspase-1前體和活性形式蛋白表達(dá)增高，而土茯苓總黃酮 （total flavonoids of Smilax glabra Roxb，TFSG）、虎杖醇提物（ethanolic extract of polygonum cuspidatum，PCE）對(duì)上述指標(biāo)具有不同程度的改善作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控NLRP3/ASC/caspase-1信號(hào)通路有關(guān)[28-29]。野菊花提取物通過調(diào)節(jié)ASC磷酸化，同時(shí)抑制NLRP3和AIM2炎癥小體激活，從而能夠抑制促炎因子的分泌和中性粒細(xì)胞的募集[30]。對(duì)白子菜提取物改善GA的研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β與caspase-1、ASC、NLRP3存在顯著相關(guān)性[31]。 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥單味藥提取物治療GA，與NLRP3炎癥小體密切相關(guān)。

2.3 中藥單體化合物 在中藥復(fù)方和中藥單味提取物的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究中藥單體化合物，對(duì)于靶向治療及新藥開發(fā)意義重大。黃芩苷、姜辣素能夠抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，并減少大鼠踝關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[32-33]。橙皮苷甲基查爾酮對(duì)GA的抗炎作用依賴于抑制NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[34]。青蒿素及其衍生物可下調(diào)經(jīng)MSU晶體及LPS處理的巨噬細(xì)胞中NIMA相關(guān)激酶7（recombinant human NIMA-related kinase 7，NEK7）-NLRP3的相互作用，減少急性GA模型小鼠細(xì)胞中鉀離子外流[35-36]。通過檢測(cè)急性期痛風(fēng)患者、間歇期痛風(fēng)患者和健康體檢者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）數(shù)量，研究發(fā)現(xiàn)急性期和間歇期痛風(fēng)患者外周血PBMCs的沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（sirtuin1，SIRT1）mRNA及蛋白水平均低于健康體檢者，NF-κB/p65 mRNA和IL-1β蛋白水平均高于健康體檢者。體外MSU干預(yù)PBMCs的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，白藜蘆醇干預(yù)組的SIRT1蛋白水平顯著高于MSU組，NF-κB/p65 mRNA及IL-1β蛋白水平則顯著降低[37]，說(shuō)明MSU晶體引起的炎癥和關(guān)節(jié)功能障礙，受到NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制NLRP3的上游信號(hào)傳導(dǎo)，通過抑制核因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號(hào)來(lái)抑制炎癥，而HO-1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可消除槲皮素對(duì)NLRP3的抑制作用[38]，說(shuō)明中藥單體化合物抗GA的機(jī)制與ROS的變化密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，姜黃素、綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠抑制小鼠原代巨噬細(xì)胞線粒體DNA的合成和ROS的產(chǎn)生[39-40]。桉油醇能減輕MSU誘導(dǎo)的體內(nèi)抗氧化酶活性的增加和ROS的降低；同時(shí)可減弱MSU誘導(dǎo)的踝關(guān)節(jié)組織和支配踝關(guān)節(jié)的背根節(jié)神經(jīng)元的瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1 （transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）表達(dá)上調(diào)，抑制NLRP3炎癥小體的生成，干預(yù)GA的進(jìn)程[41]。冬凌草甲素能夠通過與NLRP3炎癥小體279位的半胱氨酸靶向結(jié)合，激活NLRP3的核苷酸偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域 （domain present in NAIP，CIITA，HET-E and TP1，NACHT），對(duì)其NLRP3-NEK7區(qū)域產(chǎn)生抑制作用，從而抑制NLRP3炎癥小體活化，其機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥小體裝配和激活有關(guān)[42-43]。黃連堿是中藥黃連的特征性成分，能夠與caspase-1特異性結(jié)合，是有效的caspase-1抑制劑[44]。大黃酸通過抑制NLRP3和ASC的聚集，影響NLRP3炎癥小體的形成，從而抑制caspase-1的表達(dá)及活性，最終阻止炎癥信號(hào)通路的激活，發(fā)揮防治GA的作用[45]。目前大黃酸已被國(guó)家科技部列為“十五”國(guó)家重大科技專項(xiàng)研究對(duì)象，證明中藥單體的研究正從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，也預(yù)示著中藥在控制病情發(fā)展、降低不良反應(yīng)等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。因此，中藥有效單體的研究很可能成為未來(lái)抗痛風(fēng)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

中藥復(fù)方、單味藥提取物及單體化合物干預(yù)NLRP3炎癥小體抗GA的進(jìn)展總結(jié)見表1。

表1 中藥復(fù)方、單味藥提取物及單體化合物干預(yù)NLRP3炎癥小體抗GA的機(jī)制

3 討論

現(xiàn)階段針對(duì)NLRP3炎癥小體的相關(guān)機(jī)制研究包括ROS產(chǎn)生和線粒體功能障礙、氧化線粒體DNA釋放、鉀離子外流、破壞的溶酶體釋放組織蛋白酶B、細(xì)胞外鈣離子梯度的變化，磷酸化和泛素化以及跨膜孔的形成等方面。除此之外，NEK7、microRNAs誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體失活也是研究重點(diǎn)[46]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）-NLRP3雙靶向抑制劑能夠同時(shí)降低尿酸和減輕炎癥，這可能是今后治療GA的一個(gè)有前途的方法[47]。

NLRP3炎癥小體在中醫(yī)藥治療GA中發(fā)揮了重要作用，但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，因此尚未深入系統(tǒng)探討其機(jī)制，目前研究?jī)H還局限在上調(diào)保護(hù)因子TGF-β1[18]、抑制NLRP3/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]、抑制TLR/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]等方面。經(jīng)典方劑和民間醫(yī)藥往往具有更好的臨床基礎(chǔ)，療效顯著。目前以中藥有效提取物為基礎(chǔ)，進(jìn)行“新配伍”的相關(guān)研究成為新熱點(diǎn)。單味中藥提取物成分相對(duì)于復(fù)方較少，成分更加明確，是進(jìn)一步臨床研究必不可少的基礎(chǔ)。而部分中藥單體化合物，已被證明能夠與蛋白質(zhì)活性部位結(jié)合從而發(fā)揮藥理作用，如：黃連堿通過與caspase-1活性部位結(jié)合，直接抑制NLRP3炎癥小體激活[44]；蒽醌類藥物大黃酸，雖不能直接影響NLRP3與ASC的表達(dá)，但是能夠阻止其聚集，從而發(fā)揮作用[45]。

中藥能夠通過干預(yù)NLRP3炎癥小體治療GA，但相關(guān)機(jī)制有待深入研究，NLRP3炎癥小體激活調(diào)控的過程中是否還有其他蛋白的介入也有待考證，因此未來(lái)研究的重要方向是進(jìn)一步明確NLRP3炎癥小體相關(guān)通路之間的關(guān)系。同時(shí)在對(duì)GA進(jìn)行研究的同時(shí)，應(yīng)以NLRP3炎癥小體為核心，尋找治療相關(guān)并發(fā)癥的方法，并開發(fā)高效低毒的新藥。