白術(shù)-白芍藥對防治肝纖維化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

周雅 汪琪 孫慶珠 趙雨哲 張永生

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

肝纖維化是酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝癌等疾病的常見病理變化，如不及時治療，可能會導(dǎo)致肝癌和肝衰竭[1]。目前臨床上針對肝纖維化的基本治療策略是病因治療聯(lián)合抗肝纖維化治療[2]，但迄今為止尚無療效確切的抗纖維化藥物。研究證實，基于辨證的個體化和多樣化的中西醫(yī)結(jié)合治療方案在肝病領(lǐng)域有較好的優(yōu)勢[3]，“肝脾同治”治法被普遍運用，收效卓著。

白術(shù)-白芍藥對首見于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，二者合用，一陽一陰，剛?cè)嵯酀?，柔肝安脾，乃調(diào)和脾胃之常用配伍?，F(xiàn)代研究顯示，白術(shù)-白芍藥對具有保肝抗炎、抗腫瘤、保護腸黏膜等功效[4]。當(dāng)歸芍藥散、痛瀉要方、逍遙散[5]之經(jīng)典方劑中皆有該藥對，用于治療肝郁脾虛證者療效明顯。

本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選白術(shù)-白芍藥對的主要藥物成分，預(yù)測其防治肝纖維化的作用靶點及信號通路，并分析其可能的作用機制，為肝脾同治理論提供網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物成分收集與篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分別以白術(shù)、白芍為關(guān)鍵詞搜索其藥物成分，然后以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為篩選條件[6-7]，篩選出所需成分。

1.2 藥物成分中潛在作用靶點和疾病靶點的篩選在TCMSP中分別以“白術(shù)”“白芍”為關(guān)鍵詞進行搜索，選擇“Related Targets”，與符合條件的藥物成分匹配得出靶點，并將其導(dǎo)出。將獲取的藥物成分對應(yīng)的靶點信息錄入 UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，最終得出白術(shù)-白芍藥對潛在作用靶點的標(biāo)準(zhǔn)名稱。

分別在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫（Human Genome Annotation Database，GeneCards） （https://genealacart.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳在線（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）中，以“l(fā)iver fibrosis ”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取肝纖維化相關(guān)的靶點基因，導(dǎo)出結(jié)果后去重匯總，獲得肝纖維化疾病相關(guān)靶點合集。

1.3 活性成分與靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過網(wǎng)站Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es），將藥物靶點與疾病靶點進行匹配，在線繪制活性成分靶點與疾病靶點的韋恩圖，獲得白術(shù)-白芍藥對活性成分治療肝纖維化的交集靶點。通過韋恩圖可以更加直觀地看出，該藥對可通過多基因靶點治療肝纖維化。運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建白術(shù)-白芍藥對活性成分和靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，直觀展現(xiàn)出成分與靶點之間的關(guān)系，并進一步分析白術(shù)-白芍藥對配伍治療肝纖維化的作用特點。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），物種選為“Homo sapiens”，評分條件設(shè)定為0.7，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能和（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析 將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫Metoscape（http://metascape.org//），進行GO功能富集分析，包括分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）及細(xì)胞組分（cellular component，CC）三個方面；并進行KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選部分結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)-白芍藥對的活性成分 基于OB≥30%和DL≥0.18兩個并列條件，通過 TCMSP數(shù)據(jù)庫對白術(shù)-白芍藥對進行分析，共篩選出20個藥物成分，其中白術(shù)7個、白芍13個。見表1。

表1 白術(shù)-白芍藥對的活性成分Tab.1 Active components of Atractylodes macrocephala Koidz-Radix Paeoniae Alba

2.2 潛在作用靶點和疾病靶點網(wǎng)絡(luò)分析 通過TCMSP對白術(shù)-白芍藥對的20個有效活性成分進行靶點搜索，然后，通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索，將檢索對象設(shè)定為“Homo sapiens”，整理去重后獲得103個標(biāo)準(zhǔn)化基因靶點，白術(shù)18個、白芍85個。剔除無法轉(zhuǎn)換的靶點及有效成分后，使用 Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。然后利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫收集肝纖維化的相關(guān)靶點，篩選去重后獲得1 731個疾病靶點。

圖1 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Drug-component-target network

2.3 交集基因的收集和藥物-成分-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過網(wǎng)站Venny 2.1.0將上述獲取的潛在作用靶點與肝纖維化相關(guān)的疾病靶點進行匹配，得到共同靶點53個，并將其作為候選靶點。見圖2。將得到的有效活性成分和交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到“藥物-成分-靶點-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。 芍藥苷、β-谷甾醇、山柰酚、（+）-兒茶素、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮等是白術(shù)-白芍藥對干預(yù)肝纖維化的關(guān)鍵活性成分；前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）等是該藥對抗纖維化的關(guān)鍵靶點。

圖2 藥物作用靶點和肝纖維化相關(guān)靶點交集Fig.2 Interaction of herb related targets and liver fibrosis related targets

圖3 藥物-活性成分-靶點-肝纖維化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Drug-component-target-liver fibrosis network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將獲得的53個交集靶點輸入String在線數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple proteins”選項，限定物種為“Homo sapiens”，蛋白質(zhì)參數(shù)評分值＞0.7，去掉游離節(jié)點，分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將上述結(jié)果輸入Cyttoscape 3.7.2軟件中可視化，獲得 PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。 網(wǎng)絡(luò)圖涵括47個節(jié)點 （Nodes）、206條邊（Edges），Degree值為節(jié)點中心度，數(shù)值越大代表此節(jié)點與其他節(jié)點的關(guān)系更密切。根據(jù)Degree值將蛋白從大到小排列，以Degree值≥13為篩選條件，共獲得11個關(guān)鍵靶點，包括蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、白細(xì)胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、絲裂原激活蛋白激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。 見表2。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)靶點信息（前11位）Tab.2 Target information on PPI network（Top 11）

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network

2.5 GO功能分析、KEGG代謝通路富集分析結(jié)果應(yīng)用Metascape對篩選出的53個共同靶點基因進行GO和KEGG富集分析，得到白術(shù)-白芍藥對治療肝纖維化可能的分子機制與生物通道。

GO富集分析結(jié)果包括BP條目20條、CC條目11條和MF條目18條，提示白術(shù)-白芍藥對的作用涉及細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞生物調(diào)控、細(xì)胞生物合成、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等功能，其中BP涉及脂多糖應(yīng)答有毒物質(zhì)凋亡信號通路、活性氧物種代謝過程等，MF主要涉及蛋白質(zhì)同源二聚化活性核受體活性等，CC包括膜筏、胞質(zhì)核周區(qū)域等。見圖5。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

KEGG富集分析顯示共同靶點所富集的通路主要與炎癥、癌癥、動脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡等相關(guān)。顯著性程度較高的通路為糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycosylation end product-receptor of advanced glycosylation end product，AGE-RAGE）信號通路、癌癥信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、鉑劑耐藥通路、大腸癌通路、小細(xì)胞肺癌通路、肝細(xì)胞癌通路等。見圖6。

圖6 KEGG信號通路富集分析Fig.6 KEGG function enrichment analysis

3 討論

肝纖維化，屬于中醫(yī)學(xué)“臌脹”“積聚”的范疇，病位在肝，又與脾、胃、腎密切相關(guān)。慢性肝損傷的長期存在往往是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的重要因素，中醫(yī)藥可以有效減緩纖維化發(fā)展，并及時阻斷其后續(xù)傳變。白術(shù)-白芍藥對廣泛運用于肝病的治療，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)肝脾同治的理論與治未病思想[8-9]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)主要含有揮發(fā)油類、多糖類、黃酮類等活性成分，具有修復(fù)胃黏膜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，對胃腸道、免疫系統(tǒng)疾病等有一定治療作用[10-11]。白芍主要含有萜類、苷類、黃酮類和多糖類等活性成分，具有抗炎、抗菌、抗自身免疫性疾病等藥理作用[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)-白芍藥對干預(yù)肝纖維化的潛在活性成分有20個，如3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、8β-乙氧基蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、芍藥苷、β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、（+）-兒茶素等。芍藥苷是芍藥的主要成分，可能通過抑制NF-κB通路激活，從而起到保肝作用[13]；又可下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達，減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的慢性潰瘍性結(jié)腸炎[14]。 谷甾醇通過Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）/NF-κB和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體家族3（nucleotide binding oligomerization domainlike receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎性小體信號通路緩解腸黏膜功能障礙、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[15]。兒茶素和槲皮素可通過抑制TLR4-髓樣分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）介導(dǎo)的 NF-κB和MAPK信號通路的激活，從而發(fā)揮協(xié)同抗炎作用[16]。

成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)分析得出，AKT1、IL-6、MAPK8、PTGS2、Bcl-2、Bax、PPARG等靶點與白術(shù)-白芍藥對在肝纖維化方面的關(guān)聯(lián)性較高。MAPK8又被稱為c-Jun氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1），是MAPKs家族的重要成員之一，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種過程[17]。PTGS2即環(huán)氧合酶2，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[18]，研究證明其可通過誘導(dǎo)線粒體自噬而抑制肝癌細(xì)胞的生長[19]。一項系統(tǒng)評價研究提示，PTGS2表達可能與大腸癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險增加和大腸癌特異性生存率降低有關(guān)[20]。Bcl-2與Bax同屬于Bcl-2家族，在細(xì)胞凋亡中起重要作用[21]。近期研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2拮抗劑可顯著減少腸道纖維化小鼠的膠原生成，顯示了Bcl-2拮抗劑對纖維化的預(yù)防作用，這可能與抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)的成肌纖維細(xì)胞分化相關(guān)因子的表達有關(guān)[22]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示Bcl-2與Bax是白術(shù)-白芍藥對干預(yù)肝纖維化的關(guān)鍵靶點。

PPARG在糖穩(wěn)態(tài)維持和脂質(zhì)代謝中起著重要作用，而且在腎細(xì)胞癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中具有促進細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞遷移和增殖的作用[23-24]。Winkler等[25]驗證了微小RNA（micro RNA，miRNA）網(wǎng)絡(luò)可通過多種途徑發(fā)揮抗纖維化作用，而這些miRNA受轉(zhuǎn)錄因子PPARG的調(diào)控。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PPARG可調(diào)節(jié)膀胱上皮細(xì)胞線粒體功能、防止鱗狀細(xì)胞分化、控制膀胱上皮細(xì)胞中的NF-κB信號通路傳導(dǎo)，并能夠調(diào)節(jié)膀胱上皮細(xì)胞再生過程中的免疫反應(yīng)，這一點與PTGS2相似。

AKT1是3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，調(diào)節(jié)機體生長代謝和血管生成等多個過程。研究顯示，AKT1可以延緩肝癌發(fā)生[27]，因此白術(shù)-白芍藥對可能通過調(diào)節(jié)AKT1誘導(dǎo)血管新生、保護血管，從而改善肝纖維化。

KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白術(shù)-白芍藥對治療肝纖維化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號通路主要有AGERAGE、NF-κB等。Zhou等[28]研究顯示，白術(shù)-白芍藥對可通過下調(diào)MAPK和NF-κB通路中的關(guān)鍵因子，抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提示白術(shù)-白芍藥對可能通過抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗纖維化的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示白術(shù)-白芍藥對通過作用于AGE-RAGE、NF-κB等信號通路，影響PTGS2、Bcl-2、BAX、PPARG、AKT1、IL-6、MAPK8等細(xì)胞因子表達，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。肝纖維化是多種通路、多靶點參與的結(jié)果，因此逆轉(zhuǎn)肝纖維化也需要多靶點協(xié)同，本研究為下一步開展白術(shù)-白芍治療肝纖維化的機制研究提供了方向。