重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸條件優(yōu)化

劉倩妮，徐美娟，張榮珍，王梅洲，張顯，楊套偉，饒志明,2

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重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸條件優(yōu)化

劉倩妮1，徐美娟1，張榮珍1，王梅洲1，張顯1，楊套偉1，饒志明1,2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122

劉倩妮, 徐美娟, 張榮珍, 等. 重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸條件優(yōu)化. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(11): 1889–1894.Liu QN, Xu MJ, Zhang RZ, et al. Production of L-citrulline by a recombinant Corynebacterium crenatum SYPA 5-5 whole?cell biocatalyst. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1889–1894.

實現(xiàn)了精氨酸脫亞胺酶 (ADI) 首次在鈍齒棒桿菌SYPA 5-5中的高效表達(dá)。通過Ni-NTA親和層析純化得到純化ADI，經(jīng)SDS-PAGE測定其分子量約為46.8 kDa，酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)ADI的最適催化溫度為37 ℃，最適pH為6.5，ADI在最佳催化條件下作用于L-精氨酸的米氏常數(shù)為12.18 mmol/L，最大反應(yīng)速率為0.36 μmol/(min·mL)。優(yōu)化了重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)L-瓜氨酸的工藝條件，在最優(yōu)條件下可一次轉(zhuǎn)化300 g/L L-精氨酸，轉(zhuǎn)化速率達(dá)8 g/(L·h)。進(jìn)行重組菌5 L罐發(fā)酵并進(jìn)行罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化300 g/L L-精氨酸，一批菌體可進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化，累計產(chǎn)量達(dá)1 900 g以上。

精氨酸脫亞胺酶，L-瓜氨酸，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化優(yōu)化，鈍齒棒桿菌

L-瓜氨酸(L-Cit，C6H13N3O3) 是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在人體中易于消化和吸收。研究表明瓜氨酸在炎癥和敗血癥的免疫應(yīng)答中起到至關(guān)重要的作用，減少瓜氨酸在敗血癥和內(nèi)毒素血癥中的利用率將導(dǎo)致死亡率升高，補充瓜氨酸能回復(fù)精氨酸代謝平衡，提高血漿精氨酸濃度，同時提高NO的含量[1]。瓜氨酸在氮穩(wěn)態(tài)中起到重要作用，它通過精氨酸和谷氨酰胺來抑制氮素循環(huán)中的不適當(dāng)激活；利用瓜氨酸運輸NO，能治療新生兒肺動脈高壓癥[2]。瓜氨酸缺乏會導(dǎo)致一些自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和多發(fā)性硬化等[3]。

精氨酸脫亞胺酶 (ADI) 存在于生物體內(nèi)的ADI途徑即精氨酸降解途徑中，此途徑包含3種酶，分別為精氨酸脫亞氨酶 (ADI)、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶 (OTC) 和氨基甲酸酯激酶 (CK)，它們共同作用使1 mol精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸、氨和CO2并釋放出 1 mol ATP，ADI途徑是某些微生物的主要能量來源。

鈍齒棒桿菌SYPA 5-5 (SYPA 5-5)是符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的微生物菌株，發(fā)酵菌體量大，適合用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，主要用于各種氨基酸的生產(chǎn)[4]，且適用于外源酶的高效表達(dá)[5-6]。本研究室前期對該菌株有過較為深入的研究。徐美娟等[7]通過對基因進(jìn)行定點突變，提高精氨酸產(chǎn)量；滿在偉等[4,8]通過對該菌株進(jìn)行代謝工程改造，使精氨酸產(chǎn)量得到進(jìn)一步提升。本研究選取糞腸球菌來源的編碼ADI基因連接到表達(dá)載體pXMJ19上，電轉(zhuǎn)化到鈍齒棒桿菌中，構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸合成L-瓜氨酸的重組菌株。本研究首次將ADI在棒桿菌中表達(dá)，為工業(yè)化高效生產(chǎn)L-瓜氨酸提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

.由本實驗室保藏；SYPA 5-5、SYA 5、谷氨酸棒桿菌ATCC 13032由本實驗保藏[9]；表達(dá)載體pXMJ19由本實驗室保藏。

本研究所用的引物為F：5￠-ACCGGGATC CATGAGTCATCCAATTAATG-3￠(H Ⅰ)和R：5￠-ACCGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATG AAGATCTTCACGGTAAAG-3￠(R Ⅰ)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LBG培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及鈍齒棒桿菌的菌種活化、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)均參照文獻(xiàn)[10]。

1.3 試劑及工具酶

H Ⅰ、R Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、ExDNA聚合酶、dNTPs等購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司；氯霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、L-精氨酸標(biāo)樣、L-瓜氨酸標(biāo)樣購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其他分析純試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4 重組菌構(gòu)建

提取.的基因組，PCR擴增目的基因，將所得片段割膠回收后，經(jīng)H I和R I雙酶切與經(jīng)過相同雙酶切的表達(dá)載體pXMJ19連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入3種宿主感受態(tài)細(xì)胞中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和電轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)[5]操作。在LBG固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子至LBG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取得到重組質(zhì)粒pXMJ19-，并送至生工生物工程 (上海)股份有限公司測序，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組菌株。

1.5 ADI酶的表達(dá)、純化和酶活測定

將3株重組菌按文獻(xiàn)[4]方法表達(dá)，選擇酶活最高的重組ADI進(jìn)行后續(xù)實驗。N端帶有組氨酸標(biāo)簽的ADI通過Ni-NTA親和層析，利用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫獲得純化蛋白，將發(fā)酵上清、粗酶液和純化酶液經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分析重組菌表達(dá)和純化結(jié)果。

配制含終濃度0.2 mol/L L-精氨酸的底物緩沖液 (pH 6.5，0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液)，取1.8 mL底物溶液，加入0.2 mL酶液，37 ℃反應(yīng)10 min。將酶反應(yīng)液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后按文獻(xiàn)[11]測定酶活。ADI酶活定義：每分鐘催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化生成1 μmol瓜氨酸的酶量定義為一個單位ADI酶活力 (1 U)。比酶活定義：每毫克蛋白里包含的酶活數(shù)量 (U/mg)。蛋白濃度采用Bradford法測定[12]。

1.6 L-精氨酸及L-瓜氨酸含量的測定

將轉(zhuǎn)化液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以鄰苯二甲醛(OPA)作為衍生化試劑進(jìn)行氨基酸柱前衍生，利用HPLC進(jìn)行氨基酸含量的測定[13]。

1.7 重組菌C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA搖瓶培養(yǎng)及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸

將重組菌SYPA 5-5/pXMJ19-單菌落在含終濃度10 μg/mL 氯霉素的10 mL LBG液體培養(yǎng)基中于30 ℃活化24 h，并以3%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)入含50 mL LBG的250 mL搖瓶中于30 ℃培養(yǎng)，當(dāng)生長 10 h時添加終濃度為0.8 mmol/L的IPTG于30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束時4 ℃離心收集細(xì)胞，用pH 6.5、0.02 mmol/L磷酸緩沖液洗滌菌體2次，用含300 g/L L-精氨酸 (L-Arg) 的50 mL的底物溶液 (pH 6.5， 0.02 mol/L磷酸緩沖液) 重懸菌體，37 ℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.8 重組菌5 L罐發(fā)酵放大及罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸

重組菌5 L罐發(fā)酵參考文獻(xiàn)[10]方法，發(fā)酵完成后收集全部菌體用pH 6.5、0.02 mol/L磷酸緩沖液洗滌2次，再投入2 L 底物溶液 (pH 6.5，0.02 mol/L磷酸緩沖液，300 g/L L-Arg)，于37 ℃進(jìn)行罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌C. crenatumSYPA 5-5/pXMJ19-arcA的構(gòu)建

提取.的基因組，PCR擴增目的基因，按1.5中所述方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-，將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化入SYPA 5-5、SYA 5和ATCC 13032中，對獲取的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)H Ⅰ和R Ⅰ雙酶切驗證的大小約為1 200 bp。

2.2 重組ADI的表達(dá)和分離純化

將SYPA 5-5和3株重組菌SYPA 5-5/pXMJ19-、SYA 5/pXMJ19-和ATCC 13032/ pXMJ19-在相同條件下表達(dá)，并測定粗酶液酶活，結(jié)果如表1所示。重組菌SYPA 5-5/pXMJ19-的ADI酶活高于其他菌株，因此后續(xù)實驗選擇該重組菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸的進(jìn)一步研究并對其重組ADI進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。

將SYPA 5-5/pXMJ19-粗酶液進(jìn)行純化，獲得純化ADI結(jié)果如圖1所示。純化酶液在47 kDa左右出現(xiàn)一條蛋白條帶，與ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析理論ADI蛋白大小46.76 kDa相符，測定純化ADI比酶活為 (3.38±0.13) U/mg。

2.3 ADI酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 pH對ADI酶活和酶穩(wěn)定性的影響

將純化ADI在不同pH反應(yīng)體系下反應(yīng)，并將酶液分別置于冰上不同pH條件下分別保溫1 h、 2.5 h、4.5 h、6.5 h測其pH穩(wěn)定性。結(jié)果如圖2A顯示，重組ADI的最適pH為6.5，不同于小眼蟲來源的ADI，它的最適pH為9.7，是一種堿性酶[14]。如圖2B所示重組ADI在pH范圍5.0–7.0之間具有較好的穩(wěn)定性。在最適pH 6.5條件下保存6.5 h仍具有52%相對酶活。但當(dāng)pH>8.0時，重組酶的穩(wěn)定性迅速降低。

2.3.2 溫度對ADI酶活和酶穩(wěn)定性的影響

將純化ADI在不同溫度反應(yīng)體系下反應(yīng)10 min，結(jié)果如圖3A顯示，此研究中重組ADI的最適溫度為37 ℃，與變形假單胞菌來源的ADI最適溫度相似[15]。將重組酶置于不同溫度下處理研究其熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3B顯示，重 組ADI在37 ℃保存3 h仍具有50%以上相對酶活，并且在高溫50 ℃下保存0.5 h仍具有37%的相對 酶活。

2.3.3 ADI的酶動力學(xué)研究

將重組純酶與含不同摩爾濃度(0.01–0.2 mol/L)的L-Arg底物溶液 (pH 6.5，0.2 mol/L磷酸緩沖液溶液) 在37 ℃反應(yīng)10 min，測定反應(yīng)速度。以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)(1/)，L-Arg摩爾濃度的倒數(shù)(1/[]) 為橫坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖，如圖4得出ADI米氏常數(shù)m為12.18 mmol/L，最大反應(yīng)速率m值為0.36 μmol/(min·mL)。

表1 野生型菌株和重組菌ADI酶活分析

圖1 重組ADI的SDS-PAGE分析

圖2 重組精氨酸脫亞胺酶最適反應(yīng)pH(A)和pH穩(wěn)定性(B)

圖3 重組精氨酸脫亞胺酶最適反應(yīng)溫度(A) 和溫度穩(wěn)定性(B)

圖4 重組精氨酸脫亞胺酶的酶動力學(xué)常數(shù)圖

2.4 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA的 5 L罐發(fā)酵放大研究

2.4.1 初始誘導(dǎo)時間對重組菌酶活的影響

將重組菌于5 L罐培養(yǎng)，菌體轉(zhuǎn)入罐中后開始添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，設(shè)置其他組依次延后數(shù)小時添加相同濃度IPTG誘導(dǎo)，每組均于30 ℃誘導(dǎo)12 h。測定誘導(dǎo)時600，誘導(dǎo)結(jié)束時4 ℃離心收集細(xì)胞測定酶活。如圖5所示，重組菌生長 0–18 h時開始誘導(dǎo)，隨著起始誘導(dǎo)時間的增加，ADI酶活逐漸增加，當(dāng)初始誘導(dǎo)時間為18 h左右時開始誘導(dǎo)效果最好，酶活達(dá)0.34 U/mL。但當(dāng)初始誘導(dǎo)時間大于24 h后，最終酶活隨初始誘導(dǎo)時間的增加而逐漸降低。當(dāng)菌體生長96 h開始誘導(dǎo)，重組菌的酶活僅為 0.03 U/mL，僅為18 h開始誘導(dǎo)酶活的0.09倍。可見合適的誘導(dǎo)時間對高效全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-Cit十分重要。

圖5 誘導(dǎo)起始時間對重組菌酶活的影響

2.4.2 誘導(dǎo)時長對重組酶酶活的影響

重組菌在30 ℃培養(yǎng)18 h (600=17.2)時，補加IPTG至終濃度0.8 mmol/L。每隔一定時間取樣測定發(fā)酵上清液含糖量、pH值和600，開始誘導(dǎo)后每隔一定時間取菌液測定酶活。由圖6可知，當(dāng)發(fā)酵時間為48 h即誘導(dǎo)30 h時，重組菌的酶活達(dá)0.42 U/mL，此后酶活趨于穩(wěn)定，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行120 h時酶活明顯下降?？梢娭亟M菌進(jìn)行5 L罐放大時培養(yǎng)48 h效率最高。

2.5 重組C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物濃度優(yōu)化

將重組菌在含不同濃度底物L(fēng)-Arg (0–400 g/L)條件下轉(zhuǎn)化12 h，并計算L-Cit的平均生成速率。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)L-Arg濃度小于300 g/L時，隨著底物濃度的增加，L-Cit的平均生成速率逐漸增加，至200 g/L時平均生成速率升至6.74 g/(L·h)，隨后平均生成速率緩慢增加,當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到300 g/L時平均轉(zhuǎn)化速率升至7.05 g/(L·h)。然而當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?00 g/L時由于底物抑制轉(zhuǎn)化速率快速下降，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 g/L時平均生成速率僅為3.28 g/(L·h)。因此當(dāng)L-Arg濃度為200–300 g/L時，更適合L-Cit的高效轉(zhuǎn)化。

2.6 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA的 5 L罐多批次全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

將重組菌進(jìn)行5 L罐發(fā)酵，誘導(dǎo)28 h后于37 ℃進(jìn)行罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中底物L(fēng)-精氨酸將耗盡時，離心收集細(xì)胞并用磷酸緩沖液洗滌，將細(xì)胞在上述條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化，重復(fù)多次操作。結(jié)果如圖8所示，第一批次 (0–36 h) 生產(chǎn)效率最高，轉(zhuǎn)化進(jìn)行36 h時L-Cit 濃度達(dá)299.9 g/L，平均L-Cit生成速率高達(dá)8.33 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率達(dá)99%。第三批次(72–108 h) 轉(zhuǎn)化時部分菌體開始死亡，生產(chǎn)速率逐漸下降，至第 七批次 (252–348 h) L-Cit的平均生產(chǎn)速率僅為 2.66 g/(L·h)。最終在348 h內(nèi)共投入底物L(fēng)-Arg 2 100 g/L，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成L-Cit共1 940 g/L，總平均生產(chǎn)速率為5.57 g/(L·h)，總平均轉(zhuǎn)化率為92.4%。

圖6 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA的5 L罐發(fā)酵

圖7 底物濃度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

圖8 C. crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-arcA 的5 L罐多批次全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

3 討論

本研究首次將來源的ADI在棒桿菌SYPA 5-5中進(jìn)行表達(dá)，并用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸。通過酶學(xué)性質(zhì)研究得知重組酶反應(yīng)的最適溫度為37 ℃，最適pH為6.5，反應(yīng)條件溫和適用于工業(yè)化放大生產(chǎn)。重組ADI與來源的ADI最適溫度相似，但重組ADI在20–50 ℃之間相對酶活優(yōu)于來源[15]。乳酸乳球菌來源的ADI具有高達(dá)60 ℃的最適溫度[16]，但此溫度既不適合微生物生長也不利于后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)和工業(yè)化。此外重組ADI在最適反應(yīng)溫度37 ℃下保溫5 h后仍有50%以上相對酶活，在高溫50 ℃下保存0.5 h仍具有37%的相對酶活。惡臭假單胞菌來源的ADI在55 ℃ (來源ADI的最適反應(yīng)溫度為50 ℃) 下保存僅3 min，酶活降低50%[17]；來源的ADI在此酶的最適反應(yīng)溫度60 ℃下保存15 min后酶活下降一半[16]，可見來源的ADI在該酶的最適溫度下有較高的熱穩(wěn)定性。

任麗梅等將單增李斯特菌來源ADI通過大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)，通過一步酶促反應(yīng)使L-精氨酸分解生成L-瓜氨酸，5.5 h內(nèi)可使94–258 g/L的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，但需添加 7 920–17 600 U/L的ADI[18]。馬越等將ACCC 10185的ADI通過大腸桿菌表達(dá)，并將此酶用于轉(zhuǎn)化L-精氨酸鹽酸鹽生成L-瓜氨酸，在最佳轉(zhuǎn)化條件下可使650 g/L L-精氨酸鹽酸鹽于7 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，但添加酶量高達(dá)24 U/g底物[19]。酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸具有反應(yīng)條件溫和、效率高等特點，但酶轉(zhuǎn)化法對ADI酶添加量要求較高需耗費大量發(fā)酵原料且轉(zhuǎn)化過程中要求較高的酶穩(wěn)定性，但ADI酶普遍具有穩(wěn)定性不高的特點[15–17]，難以實現(xiàn)ADI酶的重復(fù)利用。本研究利用全細(xì)胞法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸，構(gòu)建重組SYPA 5-5菌株能使ADI在細(xì)胞體內(nèi)保持高效酶轉(zhuǎn)化活力，反應(yīng)條件溫和，重組菌株符合工業(yè)化安全生產(chǎn)[4]且細(xì)胞可多次利用，后續(xù)重組細(xì)胞與產(chǎn)物僅需離心便可分離，具有更好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

此前全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸文獻(xiàn)報道多集中于大腸桿菌宿主，Song等[20]將來源的ADI在BL21 (DE3)中表達(dá)，并通過易錯PCR獲得一株高酶活突變體FMMME106，此突變體能轉(zhuǎn)化176.9 g/L的L-瓜氨酸，轉(zhuǎn)化率為92.6%；Yang等[21]使用殼聚糖固定化細(xì)胞并放大到工業(yè)化規(guī)模，210 kg的固定化細(xì)胞能轉(zhuǎn)化1 000 kg L-精氨酸生成974.6 kg L-瓜氨酸。本研究首次將ADI在棒桿菌中表達(dá)，并進(jìn)行了5 L罐發(fā)酵和罐上轉(zhuǎn)化，首批次轉(zhuǎn)化300 g/L L-精氨酸轉(zhuǎn)化速率高達(dá)8.33 g/(L·h)， 轉(zhuǎn)化率達(dá)99%，SYPA 5-5表達(dá)菌株不需固定化也能進(jìn)行多批次轉(zhuǎn)化，能大大減少發(fā)酵原料和能源的消耗，且菌株多批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸的累計產(chǎn)量的產(chǎn)量能達(dá)到1 940 g/L，總平均轉(zhuǎn)化率高達(dá)92.4%。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Production of L-citrulline by a recombinantSYPA 5-5 whole?cell biocatalyst

Qianni Liu1, Meijuan Xu1, Rongzhen Zhang1, Meizhou Wang1, Xian Zhang1, Taowei Yang1, and Zhiming Rao1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Arginine deiminase (ADI) was first high-efficient expressed inSYPA 5-5. The ADI was purified by Ni-NTA affinity chromatography and SDS-PAGE analysis showed the molecular weight (MW) was 46.8 kDa. The optimal temperature and pH of ADI were 37 ℃ and 6.5 respectively. The Michaelis constant was 12.18 mmol/L and the maximum velocity was 0.36 μmol/(min·mL). Under optimal conditions, 300 g/L of arginine was transformed and the productivity reach 8 g/(L·h). The recombinant strain was cultivated in a 5-L fermentor and used for whole-cell transformation of 300 g/L arginine, under repeated-batch bioconversion, the cumulative production reached 1 900 g/L.

arginine deiminase, L-citrulline, whole-cell conversion,

January 23, 2017;

May 17, 2017

Rongzhen Zhang. Tel: +86-510-85918201; E-mail: rzzhang @jiangnan.edu.cn Zhiming Rao. Tel: +86-510-85916881; E-mail: raozhm@jiangnan.edu.cn

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2015AA021004), National Natural Science Foundation of China (No. 31300028), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BK20150002, BK20130137).

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