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    鳙魚骨酶解產物的抗氧化活性及相對分子質量分布

    2021-10-19 08:13:50張益奇姚洪正何光喜戴志遠
    中國食品學報 2021年9期
    關鍵詞:魚骨清除率蛋白酶

    董 燁,張益奇,2,3,姚洪正,何光喜,戴志遠,2,3*

    (1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州310035 2 浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室 杭州310035 3 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創(chuàng)新中心 遼寧大連116000 4 杭州千島湖發(fā)展集團有限公司 杭州311701)

    水產加工過程中通常產生大量的副產物,如魚鱗、魚鰭、魚皮、魚骨及內臟等,約占活魚體重的50%~70%[1-2],其中,魚骨含有豐富的膠原蛋白、鈣和磷等營養(yǎng)成分。然而,魚骨質構堅硬,內部的膠原蛋白由3 條螺旋鏈纏繞而成,基質附著羥基磷灰石,較難利用[3]。我國目前對魚骨的開發(fā)利用技術較為落后,大多數被直接丟棄,導致環(huán)境問題和寶貴營養(yǎng)物質的浪費。利用一些新技術手段對這些低值魚骨進行高值化、生態(tài)化利用具有一定的意義。

    酶解法制備魚類蛋白生物活性物質是近年來研究的熱點,如Garcia-moreno 等[4]研究了不同DH 藍鱈魚酶解產物的抗氧化活性、ACE 抑制活性和抗原性。Lima 等[5]研究了不同DH 石首魚副產物酶解產物的抗氧化和抗菌活性。李軍等[6]酶解鰱魚骨,分離純化得到具有高抗氧化活性的膠原多肽。水產品加工過程中產生的副產物通常作為制備酶解產物的來源。然而,作為副產物之一的魚骨,其內部膠原蛋白分子通過次級鍵形成穩(wěn)固的結構,并與羥基磷灰石牢固結合,包埋了酶的催化位點,導致酶解效率低下。因此亟需探索一些簡單高效的魚骨預處理方法。汽爆技術是一種物理化學預處理技術,可以破壞材料結構,從而提高酶解效率[7]。將原料在高壓蒸汽中保壓一段時間后瞬時泄壓,飽和蒸汽急劇膨脹而絕熱做功,產生的沖擊波對原料進行機械剪切,解離原料組分間的緊密結構[8]。因汽爆技術投資成本低,能耗低且綠色環(huán)保,在原料預處理中得到廣泛的應用[9-11]。本文以鳙魚骨為原材料,采用汽爆技術預處理魚骨,酶解制備不同水解度的魚骨酶解產物,評估魚骨酶解產物的抗氧化活性,探究魚骨酶解產物分子質量分布情況,為魚骨資源高值化的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    新鮮鳙魚骨,杭州千島湖;中性蛋白酶,源葉生物技術有限公司;復合蛋白酶、堿性蛋白酶3.0T、風味蛋白酶,諾維信公司;木瓜蛋白酶、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水楊酸、氯化亞鐵、氯化鐵、30%過氧化氫、95%乙醇、鐵氰化鉀,國藥集團化學試劑有限公司;DPPH、ABTS、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(429 u)、碳酸酐酶(29 ku)、細胞色素C(12.4 ku)、抑肽酶(6.5 ku)等,美國Sigma 公司。

    1.2 試驗儀器與設備

    e2695 高效液相色譜,美國Waters 公司;FE20 pH 計,梅特勒儀器有限公司;SPECTRA MAX190酶標儀,美國Molecular Devices 公司;QBS 200B汽爆機,正道生物能源公司;紫外-可見分光光度計、Fresco 21 冷凍高速離心機,美國Thermo Fisher 公司;400Y 多功能粉碎機,永康鉑歐五金制品有限公司;DGG-9123A 電熱恒溫鼓風干燥箱,上海森信實驗儀器有限公司;Ultra-Turrax T-18 basic 均質機,德國IKA 公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 汽爆處理[8]用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡魚骨去除雜蛋白,每隔2 h 更換1 次浸泡液,浸泡4 h 后,將魚骨取出洗至中性,瀝干備用。將汽爆機預熱,至壓力為0.6 MPa。取200 g 魚骨置汽爆機內,保壓2 min 后瞬間泄壓(前期通過對不同汽爆條件魚骨酶解特性的研究發(fā)現,當汽爆壓力0.6 MPa,保壓時間2 min 時,酶解效果較好),收集汽爆后的魚骨置40 ℃干燥箱烘干后粉碎,于-20 ℃保存待用。

    1.3.2 酶解試驗 采用堿性蛋白酶(50 ℃,pH 8.0)、木瓜蛋白酶(50 ℃,pH 7.0)、復合蛋白酶(50℃,pH 7.0)、中性蛋白酶(50 ℃,pH 7.0)和風味蛋白酶(50 ℃,pH 7.0)5 種蛋白酶,在各自最適條件下進行酶解反應。將6%汽爆魚骨粉溶液均質5 min,水浴加熱至各蛋白酶對應的最適溫度,用0.05 mol/L NaOH 調節(jié)至最適pH 值,蛋白酶添量為2%,開始反應并計時,反應過程中滴加0.05 mol/L NaOH 維持蛋白酶的最適pH 值,同時記錄NaOH 溶液的消耗量。通過消耗的NaOH 量計算DH,評價各蛋白酶的酶解效果。

    1.3.3 水解度(DH)的測定 采用pH-stat 法[12]測定水解過程中的NaOH 消耗量,計算酶解產物的DH。

    式中:B——消耗NaOH 體積,mL;Nb——NaOH 濃度,mol/L;α——α 氨基的解離度;MP——底物中蛋白質總量,g;htot——底物中蛋白質肽鍵總數,mmol/g。

    1.3.4 不同DH 的魚骨酶解產物的制備 使用堿性蛋白酶和復合蛋白酶制備不同DH 的魚骨酶解產物,分別記為HA 和HP。通過控制NaOH 消耗量來制備不同DH 的酶解產物。當DH 分別達到5%,10%,15%時,停止滴加堿液,置沸水浴中滅酶10 min,8 000 r/min 離心15 min,取上清液(分別記為HA5、HA10、HA15、HP5、HP10 和HP15),冷凍干燥,備用。

    1.3.5 抗氧化活性評價

    1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的測定 參考Chen等[13]方法,稍作修改。取將1 mL DPPH 溶液(0.15 mmol/L),與1 mL 酶解液混合,室溫(25 ℃)下避光靜置30 min,在波長517 nm 處測定該混合物的吸光度A1,將1 mL 酶解液與1 mL 95%乙醇混合后測定其吸光度A2,1 mL 超純水與1 mL DPPH 乙醇(95%)混合后測定其吸光度A3。計算DPPH 清除率公式:

    1.3.5.2 ABTS 自由基清除率的測定 參考Ketnawa 等[14]方法配制ABTS 母液,于室溫避光反應12~16 h,用pH 7.4 的0.2 mol/L PBS 緩沖液稀釋ABTS 母液,使其在波長734 nm 處的吸光值為0.7±0.02。移取50 μL 樣品與150 μL ABTS 溶液于96 孔酶標板上混勻,室溫下避光反應6 min后,于波長734 nm 處測定吸光值(A1)。用50 μL超純水代替樣品的反應體系為控制組(A2),以150 μL PBS 代替ABTS 溶液的反應體系為樣品空白組(A3),以50 μL 超純水和150 μL PBS 緩沖液分別代替樣品和ABTS 溶液的反應體系為空白組(A4)。

    1.3.5.3 羥基自由基清除率的測定 參考崔帥[15]的方法,稍作修改。依次加入350 μL 超純水、50 μL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、50 μL 樣品、50 μL 9 mmol/L 的氯化亞鐵溶液、50 μL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液,混勻后于37 ℃保溫15 min,在波長510 nm 處測溶液的吸光度。A1為樣品的吸光度;A2為50 μL 超純水代替氯化亞鐵溶液測得的吸光度;A3為50 μL 超純水代替樣品測得的吸光度。

    1.3.5.4 還原力的測定 參考賈韶千等[16]的方法,移取200 μL 樣品與500 μL 1%鐵氰化鉀溶液混合,50 ℃水浴20 min,加入500 μL 10% TCA 終止反應。將反應液以6 000 r/min 離心5 min,取上清液500 μL 于離心管中,分別加入500 μL 超純水和200 μL 0.1%氯化鐵溶液,搖勻后置50 ℃水浴10 min。取200 μL 溶液于波長700 nm 處測定吸光值。將200 μL 超純水代替氯化鐵作為空白對照。

    1.3.6 相對分子質量 參照Zhang 等[17]的方法,采用Waters e2695 高效液相系統,色譜柱為TSKgel G2000 SWxl(7.8 mm×300 mm,Tosoh),UV/Vis 檢測器,檢測波長220 nm,洗脫液為45%乙腈-55%水溶液(0.1% TFA),0.5 mL/min 等度洗脫,時間30 min,進樣量10 μL。采用細胞色素C、碳酸酐酶、抑肽酶和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸作標準品。以分子質量的對數(lgM)為縱坐標,各標準品保留時間(t)為橫坐標作圖,通過標準曲線計算樣品相對分子質量分布情況。

    1.4 數據處理

    用OriginPro2018 作圖,SPSS 21.0 軟件處理數據,以平均數±標準差(±s)表示,用多重比較分析法進行顯著性檢驗(P<0.05)。

    2 結果與分析

    2.1 不同蛋白酶對鳙魚骨的酶解效果

    水解度(DH)可作為肽鍵斷裂的一個指標[18]。不同種類的蛋白酶的底物特異性和作用的酶切位點不同,導致酶解產物DH 和氨基酸序列不同,從而影響產物的結構、組成和功能[19]。由圖1 可知,DH 隨酶解時間的延長逐漸增大,在前30 min DH增加較快,隨后逐漸趨于平緩,這可能是由于隨著酶解的進行,有效酶切位點逐漸減少。不同蛋白酶對魚骨的酶解效果差異較大,堿性蛋白酶處理的水解產物的DH 最高,在300 min 時達21.03%,其次為復合蛋白酶,而風味蛋白酶處理的酶解產物的DH 最低。最終選擇堿性蛋白酶和復合蛋白酶作為后續(xù)魚骨酶解用酶。

    圖1 蛋白酶對魚骨水解度的影響Fig.1 Effect of proteases on DH of fish bone

    2.2 魚骨酶解產物的抗氧化活性

    2.2.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH 是一種大分子自由基,反映酶解產物的自由基清除能力,是評價酶解產物體外抗氧化能力的重要指標[20]。不同酶的酶解產物的氨基酸序列不同,對DPPH自由基的清除能力也不同。由圖2 可看出,堿性蛋白酶酶解產物(HA)和復合蛋白酶酶解產物(HP)對DPPH 自由基的清除活性均隨樣品濃度的增加而顯著增加(P<0.05)。HP 對DPPH 自由基的清除活性高于HA,這可能是由于復合蛋白酶獲得的酶解物具有更強的供氫作用,從而對DPPH 自由基具有更好的清除活性。當DH 為10%時,HP 表現出較強的DPPH 自由基清除率,其IC50值為2.85 mg/mL,而HA10 的IC50值為6.67 mg/mL,差異顯著(P<0.05),表明HP10 中含有較多的抗氧化組分。

    圖2 不同水解度魚骨酶解產物的DPPH 自由基清除率Fig.2 DPPH scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

    2.2.2 ABTS 自由基清除能力 ABTS 自由基清除法常用于評價親水性和親脂性化合物的抗氧化活性[21]。圖3 顯示不同DH 條件下酶解產物的ABTS自由基清除能力,表明ABTS 自由基清除活性受酶解液濃度的影響,在試驗濃度范圍,隨著酶解液濃度的增大,其清除活性增大,具有一定的量效關系。隨著DH 的增大,兩種酶解物對ABTS 自由基清除能力呈先增大后減小的趨勢。HP10 具有較好的ABTS 自由基清除能力,這與DPPH 自由基清除能力的結果相同。酶解產物清除自由基的能力不僅與肽鏈的分子質量大小有關,還與酶解過程中所用酶的特異性有關[22],在同一DH 下,HP10 的IC50值為0.99 mg/mL,而HA10 的IC50值為1.59 mg/mL,差異顯著(P<0.05)。從兩種酶解產物對ABTS 自由基清除能力的IC50值可看出,酶解產物對ABTS 自由基的清除能力優(yōu)于DPPH 自由基清除能力,這與Latorres 等[23]的研究結果一致。

    圖3 不同水解度魚骨酶解產物的ABTS自由基清除率Fig.3 ABTS scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

    2.2.3 羥自由基清除能力 羥基自由基可與生物體內的任何物質發(fā)生反應,特別是與蛋白質、DNA和脂類等大分子物質,會導致細胞衰老、癌癥和一些疾病的發(fā)生[24],因此,清除羥基自由基對生物體至關重要。HA 和HP 不同DH 清除羥基自由基的能力如圖4所示。羥基自由基清除能力與酶解液濃度呈正相關。當酶解液質量濃度為6 mg/mL 時,HA15(54.40%)具有與HP15(54.96%)相似的羥基自由基清除能力。HA 對羥基自由基的清除能力隨DH 的增加而增加,HA15 的IC50值為7.09 mg/mL,而HP 對羥基自由基清除能力隨DH 呈先增大后減小趨勢,這與ABTS 自由基清除能力相似。HP10 羥基自由基清除能力較高,IC50值為4.91 mg/mL,而HA10 的IC50值為8.33 mg/mL,差異顯著(P<0.05)。

    圖4 不同水解度魚骨酶解產物的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

    2.2.4 還原力的測定 Fe3+還原試驗常用于評價抗氧化劑提供電子或氫將Fe3+還原為Fe2+的能力,具有抗氧化活性的小分子肽和氨基酸的存在會影響樣品的還原能力[25]。酶解產物的還原能力可用來測量其抗氧化能力,在波長700 nm 處,吸光度值越大,酶解產物的還原力越強,其抗氧化能力越高。如圖5所示,所有酶解產物的還原力水平均隨濃度的增加而增加。在相同濃度下,HA 的還原力高于HP。HA15 的還原能力最強,當質量濃度為8 mg/mL 時其吸光度值為0.75。酶的種類影響酶解產物的還原能力,在相同的DH 下,HA 和HP 酶解物還原能力差異顯著(P<0.05)。在HA 體系,酶解物隨DH 的升高,還原力顯著增強(P<0.05)。而在HP 體系,DH 對其還原力影響不大(P>0.05)。

    圖5 不同水解度魚骨酶解產物的還原能力Fig.5 Reducibility of fish bone hydrolysates with different DHs

    2.3 分子質量分布

    測定了6 種酶解產物的分子質量分布。將其分為4 個部分:>1 500 u、1 000~1 500 u、1 000~200 u 和<200 u。由圖6 可知,隨著水解程度的加大,酶解產物的分子質量發(fā)生顯著變化,大分子肽的比例下降,小分子肽的比例上升(P<0.05)。由圖7 可知,當水解度達15%時,HA15 和HP15 的分子質量在1 000 ~200 u 的比例分別達到96.92%和85.95%,酶解效果較好。這是由于隨著酶解時間的增加,蛋白質分子間的肽鍵不斷斷裂,形成越來越多的小分子肽,分子質量減小。

    圖6 魚骨酶解物的分子質量分布色譜圖Fig.6 Chromatogram of molecular weight mass distribution of fish bone hydrolysates

    圖7 魚骨酶解物的分子質量分布Fig.7 Distribution of molecular weight of fish bone hydrolysates

    3 結論

    以汽爆鳙魚骨為原料,以DH 為指標,篩選出堿性蛋白酶和復合蛋白酶兩種蛋白酶酶解汽爆魚骨粉,制備不同DH 的魚骨酶解液,研究其抗氧化活性及分子質量分布。結果表明,不同DH 的魚骨酶解物的抗氧化活性隨酶解產物濃度的增大而增強,呈現良好的量效關系。HA 具有較好的還原能力,而HP 具有較好的DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥自由基清除能力,當DH 為10%時,HP10對這3 種自由基清除率的IC50值分別為2.85,0.99 mg/mL 和4.91 mg/mL,分子質量主要分布在500 u以下,達75.08%。在還原力和羥自由基體系,隨著DH 的增加,HA 的抗氧化活性隨DH 的增大而逐漸增強,而HP 與DH 之間沒有顯著的一致性規(guī)律。在ABTS 體系,HA 和HP 的抗氧化活性隨DH的增大呈現先增強后減小的趨勢。隨著DH 的增大,蛋白質間的肽鍵不斷斷裂,大分子逐漸降解,HA 和HP 的小分子質量肽不斷增多。魚骨質構堅硬,利用率低,采用汽爆技術預處理魚骨,研究其酶解產物的抗氧化性,可為提高魚骨資源利用率提供理論依據。今后還需開展汽爆處理對魚骨結構影響及酶解產物應用的研究。

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