清酒乳桿菌對臭鱖魚食用品質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

周迎芹，楊明柳，殷俊峰，鄢 嫣，林心萍，謝寧寧*

（1 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 合肥230031 2 安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室 合肥230031 3 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山316022 4 大連工業(yè)大學(xué)國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連116034）

鱖魚（Siniperca chuatsi），俗稱桂花魚，屬鱸形目、鮨科、鱖亞科、鱖屬[1]，是廣泛分布于我國各主要江河湖泊的名貴食用魚類，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高[2-3]。以鱖魚為原料加工的傳統(tǒng)發(fā)酵食品——黃山臭鱖魚，在保留鱖魚鮮美味道的同時(shí)，新增了獨(dú)具似臭非臭、香鮮透骨、Q 彈嫩滑的特殊口感和風(fēng)味，深受人們喜愛[4-5]。

近年來，在安徽黃山地區(qū)，臭鱖魚產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止至2018年10月，黃山臭鱖魚加工企業(yè)達(dá)40 余家，年總產(chǎn)值超過10 億元，對當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展和促進(jìn)工人增收具有重要意義。目前臭鱖魚加工工藝仍沿用落后的傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式，加工過程更多依靠生產(chǎn)者的經(jīng)驗(yàn)判斷，發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定性差，產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)參差不齊[6]，很大程度上制約了臭鱖魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。乳酸菌接種發(fā)酵是一種改善發(fā)酵食品品質(zhì)的優(yōu)良方法[7]，在各類食品，如乳制品[8-9]、泡菜[10-11]、果蔬汁飲料[12-13]、調(diào)味品[14]、豆制品[15]、肉制品[16]等中有廣泛應(yīng)用。將乳酸菌發(fā)酵劑用于臭鱖魚腌制，有望使臭鱖魚的品質(zhì)得到改善。

有研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌是臭鱖魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物之一[17-18]，而其對臭鱖魚食用品質(zhì)、風(fēng)味特征等的影響尚未見報(bào)道。腌制發(fā)酵賦予臭鱖魚典型的品質(zhì)特征，即魚肉片片如蒜瓣，呈聞臭吃香的特殊風(fēng)味。本試驗(yàn)采用清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚，以自然發(fā)酵作為對照，研究菌株對臭鱖魚發(fā)酵過程中特征蒜瓣肉的變化以及對質(zhì)構(gòu)、色澤和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱖魚（秋浦花鱖），東至縣大聯(lián)圩有限公司，質(zhì)量規(guī)格為0.5～0.6 kg。食用鈉鹽、花椒，合肥市廬陽區(qū)中菜市。氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇等常規(guī)化學(xué)試劑（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。氣相色譜-離子遷移譜測試用標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma-Aldrich 公司。清酒乳桿菌，從丹麥科漢森B-2 發(fā)酵劑中活化培養(yǎng)獲得。

1.2 儀器與設(shè)備

臭鱖魚腌制發(fā)酵專用裝置，本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)[19]；CR-400 色差分析儀，柯尼卡美能達(dá)控股公司；TA.XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System 公司；FlavourSpecR氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀，德國G.A.S.公司。

1.3 方法

1.3.1 鱖魚腌制發(fā)酵 腌制發(fā)酵工藝：新鮮鱖魚宰殺→清洗→碼放→腌制→發(fā)酵→真空包裝→貯藏

自然發(fā)酵：選擇0.5～0.6 kg 的標(biāo)準(zhǔn)鱖魚作為腌制原料，宰殺去內(nèi)臟、鰓和鱗，用自來水和10%鹽水先后清洗1 次，待用。將魚平整碼放于鱖魚發(fā)酵專用裝置內(nèi)，一桶約碼放30 kg，每碼一層，撒若干粒炒制花椒（15 g），碼放結(jié)束后在上層魚體上放置按壓板，并向桶內(nèi)加入提前配制好的腌制液（11 kg 的8%鹽水），按壓板上放置扁圓狀砝碼（12 kg），用以將魚體全部浸壓于腌制液液面以下。合上發(fā)酵裝置頂蓋，以厭氧發(fā)酵方式，于8 ℃條件下發(fā)酵16 d，按發(fā)酵0，0.5，1，2，4，6，8，10，12，14，16 d 取樣，每個(gè)階段各取4 條魚，真空包裝貯藏于-18 ℃冰箱，備用。

接種發(fā)酵：除腌制液為8%鹽水（11 kg）和清酒乳桿菌37.5 g（按菌體濕重計(jì)）的混合液外，其它步驟同自然發(fā)酵方法。

1.3.2 特征蒜瓣肉觀察 取各階段樣品魚1 條，解凍，用解剖刀沿魚的脊背和鰓蓋后沿將兩側(cè)魚皮劃裂，輕輕剝離至尾部，切取同側(cè)的、沿背鰭下方至側(cè)線之間的肌肉塊。將肌肉塊放入蒸鍋中隔水蒸煮10 min，取出，室溫下冷卻后剝離蒜瓣肉，肉眼觀察并拍照。

1.3.3 色澤和質(zhì)構(gòu)測定 取各階段樣品魚3 條，解凍，并用解剖刀沿脊背和鰓蓋后沿將兩側(cè)魚皮劃裂，并輕輕剝離至魚尾，切取魚體全部肌肉并用料理機(jī)絞成魚肉糜，分別將各階段3 條魚的肉糜合并，攪拌均勻，取200 g 魚肉糜灌入聚乙烯塑料腸衣中（25 mm），打卡封口，魚肉腸長度均為10 cm。將灌制好的魚肉腸放入蒸鍋蒸煮10 min，待取出，冷卻至室溫后測定魚肉色澤和質(zhì)構(gòu)。

色澤和質(zhì)構(gòu)的測定參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行[20]，色澤測定指標(biāo)包括亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*），利用L*、a*和b*值按公式（1）計(jì)算樣品白度[21]。

質(zhì)構(gòu)測定指標(biāo)包括硬度、黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性。色澤和質(zhì)構(gòu)各參數(shù)測定值均以平均值表示。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定 利用氣相色譜-離子遷移譜儀，并依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法步驟測定魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[20]。按1.3.3 節(jié)步驟制作肉糜，準(zhǔn)確稱取各階段魚肉糜1 g，分別置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，擰緊瓶蓋，放入GC-IMS 頂空進(jìn)樣器上（每個(gè)階段設(shè)置3 個(gè)平行樣品）。

頂空進(jìn)樣條件：孵化溫度40 ℃，孵化時(shí)間20 min，進(jìn)樣針溫度85 ℃，進(jìn)樣體積500 μL，振動(dòng)速度500 r/min。

色譜條件：色譜柱為FS-SE-54-CB-0.5 15 mm，ID：0.53 mm，色譜柱溫度40 ℃，分析時(shí)間40 min。載氣為高純N2，流速設(shè)置：0～2 min（2 mL/min），2～10 min（2～15 mL/min），10～20 min（15～80 mL/min），20～25 min（100～130 mL/min），25～40 min（130～145 mL/min）。

離子遷移譜條件：漂移氣為高純N2，流速150 mL/min，IMS 探測器溫度45 ℃。

GC-IMS 在正離子模式下通過有線網(wǎng)絡(luò)將數(shù)據(jù)傳輸并保存到計(jì)算機(jī)中，每張譜圖平均掃描32次，使用網(wǎng)格脈沖寬度為100 μs，重復(fù)率為21 ms，采樣頻率為150 kHz。采用儀器內(nèi)置的LAV軟件（Laboratory Analytical Viewer）、GC-IMS Library Search Software 軟件對樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的指紋圖譜分析和物質(zhì)定性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 進(jìn)行整理和計(jì)算，并用Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 清酒乳桿菌接種發(fā)酵對臭鱖魚特征蒜瓣肉的影響

腌制發(fā)酵而成的臭鱖魚，其典型的品質(zhì)特征就是魚肉呈蒜瓣?duì)?。沿背鰭下方至?cè)線之間的肌肉，其蒜瓣?duì)钣葹槊黠@。蒸煮后通過剝離可以發(fā)現(xiàn)，臭鱖魚的蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)是在腌制發(fā)酵過程中逐漸形成的（圖1 和圖2）。發(fā)酵初期開始形成蒜瓣?duì)?，至中后期時(shí)，魚肉逐漸變白，蒜瓣?duì)钜仓饾u明顯。接種清酒乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵后，魚肉的蒜瓣?duì)钤诎l(fā)酵0.5 d 即初步形成，較自然發(fā)酵更早出現(xiàn)，整個(gè)發(fā)酵過程的蒜瓣?duì)畋茸匀话l(fā)酵更規(guī)則，魚肉也更白亮。

圖1 自然發(fā)酵（a）和接種發(fā)酵（b）過程中特征蒜瓣的變化Fig.1 Changes of characteristic garlic clove during natural fermentation（a）and inoculated fermentation（b）

2.2 清酒乳桿菌接種發(fā)酵對臭鱖魚色澤和質(zhì)構(gòu)的影響

在自然、接種發(fā)酵過程中，魚肉亮度L*在發(fā)酵2 d 內(nèi)逐漸增強(qiáng)，發(fā)酵2～16 d 時(shí)呈緩慢減弱趨勢（圖2a），a*值和b*值在發(fā)酵過程中呈逐漸降低趨勢（圖2b、2c），魚肉白度變化趨勢同亮度變化趨勢（圖2d）。發(fā)酵過程中3 個(gè)指標(biāo)的綜合變化，使魚肉白度得到提升（圖3）?？傮w來說，清酒乳桿菌接種發(fā)酵能夠改善臭鱖魚魚肉色澤。

圖2 自然、接種發(fā)酵過程中色澤的變化Fig.2 Changes of color during natural fermentation and inoculated fermentation

圖3 自然、接種發(fā)酵臭鱖魚成品色澤的比較Fig.3 Comparison of color of stinky mandarin fish by natural fermentation and inoculated fermentation

在自然、接種發(fā)酵過程中，魚肉質(zhì)構(gòu)變化均較為明顯，其中硬度、膠黏性和咀嚼性的變化趨勢基本一致，即呈先降低后增加趨勢，黏附性在發(fā)酵剛開始即有顯著變化，在0.5 d 時(shí)達(dá)最大值，0.5 d 后保持恒定，彈性指標(biāo)從發(fā)酵開始至發(fā)酵結(jié)束逐漸增加，在發(fā)酵4 d 內(nèi)增加趨勢較為明顯，發(fā)酵中后期則無明顯增加趨勢?？傮w來說，鱖魚在發(fā)酵后硬度降低，其它參數(shù)值均增加（圖5）。接種發(fā)酵臭鱖魚成品與自然發(fā)酵臭鱖魚成品相比，硬度降低，彈性、黏附性、膠黏性和咀嚼性增加，表明接種發(fā)酵后，質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的綜合變化使臭鱖魚魚肉更為Q 彈。

圖4 自然、接種發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)的變化Fig.4 Changes of texture during natural fermentation and inoculated fermentation

圖5 自然、接種發(fā)酵臭鱖魚成品質(zhì)構(gòu)的比較Fig.5 Comparison of the texture of stinky mandarin fish by natural fermentation and inoculated fermentation

2.3 清酒乳桿菌接種發(fā)酵對臭鱖魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

通過GC-IMS 對臭鱖魚在自然、接種發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測和分析，共鑒定出36 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（表1），其中醇類11 種、酮類8 種、醛類5 種、酯類5 種、酸類2 種、醚類3種、烯烴類2 種。

表1 臭鱖魚發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 The volatile flavor components during fermentation of stinky mandarin fish

利用GC-IMS 儀器內(nèi)置的LAV 軟件將樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的特征信號峰生成指紋圖譜（圖6）。在圖譜中，每縱列特征信號峰對應(yīng)一種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，信號峰上顏色由白到黑表示物質(zhì)濃度由低到高。新鮮鱖魚主要含有甲硫醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、壬醛、苯甲醛、甲硫基丙醛、3-戊酮、2，3-戊二酮、甲乙酮、丙酸乙酯和乙酸己酯等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，一經(jīng)腌制發(fā)酵，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及含量隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行在不斷變化。自然發(fā)酵初期（圖6a），0.5～2 d 內(nèi)所含揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類較少，且比新鮮鱖魚中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類更少，發(fā)酵至2 d 時(shí)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類開始增加，主要包括乙酸己酯；發(fā)酵2～8 d，新增較多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類，主要包括芳樟醇、4-甲基-2-戊酮、3-辛酮、乙酸乙酯、己酸和檸檬烯等；8～16 d，較少產(chǎn)生新物質(zhì)，魚肉中5-甲基-2-呋喃甲醇、丙醇等含量明顯增加，異丁醇、羥基丙酮、乙酸乙酯、丁酸乙酯等含量明顯降低。與自然發(fā)酵相比，清酒乳桿菌接種發(fā)酵對臭鱖魚風(fēng)味品質(zhì)具有明顯影響（圖6b）。對比發(fā)酵成熟臭鱖魚的GC-IMS 指紋圖譜（圖7）來看，自然、接種發(fā)酵臭鱖魚成品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在差異。接種清酒乳桿菌發(fā)酵臭鱖魚中，丁酸乙酯、乙酸己酯、羥基丙酮、2，3-丁二醇、玫瑰醚、甲硫醇、2，3-戊二酮、甲硫基丙醛、2-辛醇、丙醇和4-甲基-2-戊酮等的含量明顯低于自然發(fā)酵臭鱖魚，而芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯、檸檬烯等揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量比自然發(fā)酵臭鱖魚明顯增加，表明清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚，能夠降低魚肉中甲硫醇等惡臭氣味的產(chǎn)生和促進(jìn)芳樟醇等香氣物質(zhì)的生成。

圖6 自然發(fā)酵（a）和接種發(fā)酵（b）過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Fig.6 Changes of volatile flavor during natural fermentation（a）and inoculated fermentation（b）

圖7 自然、接種發(fā)酵臭鱖魚成品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成Fig.7 Volatile flavor constituents in finished products of stinky mandarin fish by natural fermentation（a）and inoculated fermentation（b）

（續(xù)表1）

清酒乳桿菌具快速產(chǎn)酸、產(chǎn)細(xì)菌素和抑制雜菌生長的能力[22]，在接種發(fā)酵臭鱖魚時(shí)，可能是通過改變菌群結(jié)構(gòu)，抑制產(chǎn)臭微生物生長和減少細(xì)菌種類、數(shù)量，形成優(yōu)于自然發(fā)酵臭鱖魚的風(fēng)味。芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和檸檬烯均為香辛料中揮發(fā)性物質(zhì)，賦予臭鱖魚具有植物花香的風(fēng)味特征，是在腌制發(fā)酵過程中由添加的花椒所帶入[23]。在植物花椒中，這些物質(zhì)也是其本身主要的揮發(fā)性物質(zhì)[24]。隨著腌制發(fā)酵過程的進(jìn)行，花椒中的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)滲透作用逐漸進(jìn)入魚體，構(gòu)成魚肉重要的風(fēng)味物質(zhì)。清酒乳桿菌接種發(fā)酵后，可能有利于花椒中的揮發(fā)性物質(zhì)滲入至發(fā)酵液中。在臭鱖魚風(fēng)味研究中，芳樟醇是臭鱖魚中常見的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[25-27]，且被認(rèn)為是對臭鱖魚整體風(fēng)味品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味活性物質(zhì)[26-27]。在本研究中，清酒乳桿菌的接入，使臭鱖魚中芳樟醇等香氣物質(zhì)得到更多積累，對產(chǎn)品風(fēng)味具有提升作用。

3 結(jié)論

本研究通過對比自然發(fā)酵和清酒乳桿菌接種發(fā)酵臭鱖魚發(fā)酵過程中特征蒜瓣、色澤、質(zhì)構(gòu)等食用品質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌接種發(fā)酵能使臭鱖魚在發(fā)酵過程中的特征蒜瓣形成提前，且蒜瓣肉更規(guī)則；接種發(fā)酵組臭鱖魚的色澤，包括亮度和白度均優(yōu)于自然發(fā)酵組臭鱖魚，魚肉硬度低于自然發(fā)酵組，且彈性、黏附性、膠黏性和咀嚼性均高于自然發(fā)酵組；從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果來看，自然、接種發(fā)酵過程中的揮發(fā)性物質(zhì)均在不斷地變化，清酒乳桿菌接種發(fā)酵對臭鱖魚風(fēng)味物質(zhì)形成具有明顯影響，發(fā)酵成品中產(chǎn)惡臭味的甲硫醇含量明顯減少，帶有植物花香的物質(zhì)，包括芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和檸檬烯等的含量明顯增加，對產(chǎn)品風(fēng)味具有提升作用。