卵白蛋白體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物的抗氧化活性及其結(jié)構(gòu)表征

姜 豐，劉靜波，馬思彤，楊 萌，陳 艷，劉博群，張 婷*

（1 吉林省營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)春130062 2 吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春130062）

雞蛋富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是人們餐桌上常見的蛋白質(zhì)來源[1]。蛋白質(zhì)主要分布在蛋清和蛋黃中，蛋清中蛋白以卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵黏蛋白以及伴白蛋白等形式存在；蛋黃中蛋白以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和肝素等形式存在[2-3]。研究表明，雞蛋中多種蛋白具有抗氧化活性，其中，卵白蛋白作為蛋清蛋白的主要成分，約占54%，是一種由385 個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，含有6 個(gè)具有二硫鍵的半胱氨酸殘基，是唯一含有游離硫醇基團(tuán)（SH）的蛋清蛋白[2，4]，因而卵白蛋白能與自由基直接反應(yīng)，從而具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5-6]。Liu等[7]為改善姜黃素的功能特性，利用卵白蛋白制成卵白蛋白-姜黃素復(fù)合物，與純姜黃素相比，復(fù)合物的抗氧化活性提高。

目前對(duì)卵白蛋白抗氧化性的研究主要集中在酶解或改性前、后體外活性評(píng)價(jià)。卵白蛋白最終對(duì)人體的健康益處與其在體內(nèi)的生物利用度密切相關(guān)。評(píng)價(jià)生物利用度有體內(nèi)和體外兩類模型，體內(nèi)主要是動(dòng)物模型。動(dòng)物模型雖然能夠真實(shí)地還原生理?xiàng)l件下的消化過程，但是存在以下問題：實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，并且由于個(gè)體差異問題，容易造成結(jié)果的重復(fù)性差。評(píng)價(jià)卵白蛋白生物利用度的體外模型主要是體外模擬胃腸道消化模型，體外模擬消化能夠在一定程度上模擬生理狀況，并且試驗(yàn)易操作，成本低、周期短[8-9]。

本試驗(yàn)以卵白蛋白及其體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物為研究對(duì)象，探究卵白蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后的抗氧化活性變化。測(cè)定其ABTS+·清除活性和ORAC，評(píng)價(jià)體外抗氧化活性。利用H2O2誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞氧化損傷，構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，探究其體內(nèi)抗氧化活性。以期闡明卵白蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后抗氧化活性變化規(guī)律，為后續(xù)研究蛋白及其產(chǎn)物在體內(nèi)消化、吸收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2’-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH）、熒光素鈉、細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè)試劑盒等，美國(guó)Sigma 公司；合成肽CFDV、CVSP、MPFR（純度＞95%），生工生物工程（上海）股份有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2），中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM 培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco 公司；H2O2（分析純），北京化工廠；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（MTS），美國(guó)Promega 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；黑色孔板（透明平底），德國(guó)Greiner Bio-One 公司；移液器，德國(guó)Eppendorf 公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；EASY-nLC 1000 液相色譜儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司；Orbitrap EliteTM組合型離子阱Orbitrap 質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃腸道消化 參照Alting 等[33]報(bào)道的方法并稍作修改。稱取10 g 卵白蛋白，加入1 L 蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的蛋白溶液。加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶（EC 3.4.23.1，來源于豬胃黏膜，酶活力為3 000 units/mg），用1 mol/L 的HCl將pH 值調(diào)至2，保持體系溫度在37 ℃，持續(xù)酶解90 min。用1 mol/L 的NaOH 調(diào)pH 值至7，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的胰液（EC 3.4.21.4，來源于豬胰腺，酶活力為250 units/mg），保持溫度37 ℃和pH 7，持續(xù)酶解4 h。將體系沸水浴10 min 滅活蛋白酶，冷卻至室溫。將酶解液離心，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集上清液，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.2.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物ABTS+·清除能力測(cè)定 配制7 mmol/L ABTS 溶液和4.9 mmol/L 的K2S2O8溶液，將二者等體積混合配置得到ABTS 儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液于室溫避光條件下靜置12～16 h后，用PBS 將儲(chǔ)備液稀釋20～30 倍，使其在734 nm 下的吸光度為0.7±0.02，形成ABTS 工作液。96孔板按如下設(shè)置加入溶液：空白組：200 μL PBS、對(duì)照組180 μL ABTS 工作液和20 μL PBS 以及試驗(yàn)組：180 μL ABTS 工作液和20 μL 樣品溶液（0.5，1，5 和10 μg/mL），每組3 個(gè)復(fù)孔。將96 孔板放入酶標(biāo)儀中，振蕩10 s 后，室溫靜置5 min 后，測(cè)定反應(yīng)體系在734 nm 下的吸光度值。計(jì)算ABTS 自由基清除能力（%）的公式為：

式中：A0——空白組的吸光度；A1——對(duì)照組的吸光度；A2——試驗(yàn)組的吸光度。

樣品的ABTS 自由基清除能力用Trolox 抗氧化當(dāng)量（TEAC，μmol/L TE/g 樣品）表示，即一定濃度的樣品溶液相當(dāng)于多少濃度的Trolox 溶液。

從式中可以得出，當(dāng)旋流器直徑增加時(shí)，其處理量成Q∝D2增加，礦漿向心流速減小，而由于分級(jí)粒度d∝D，則旋流器直徑越大分級(jí)粒度越大，所以大直徑旋流器可以提高分級(jí)下限，提高底流中粗粒級(jí)的含量?；诖?，決定將3338號(hào)旋流器組更換為大直徑水力旋流器。

1.3.2.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物ORAC 測(cè)定 配制116 nmol/L 的熒光素鈉溶液和40 mmol/L 的AAPH 溶液。在黑色96 孔板中首先按如下設(shè)置加入溶液，空白組：120 μL 熒光素鈉溶液和20 μL PBS；樣品組：120 μL 熒光素鈉溶液和20 μL 樣品溶液（10 μg/mL）；Trolox 組（標(biāo)準(zhǔn)品組）：120 μL 熒光素鈉溶液和20 μL Trolox 溶液（1 μg/mL），混合上述體系，在37 ℃下預(yù)熱2 min 后，快速加入60 μL AAPH 溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。將黑色96 孔板立即放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置溫度37 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，每隔2 min 振板10 s 并檢測(cè)1 次，連續(xù)測(cè)定600 min。將每次測(cè)定值連成曲線，按下述公式計(jì)算熒光曲線下的面積：

式中：f0——0 min 時(shí)的測(cè)定值；fi——imin 時(shí)的測(cè)定值。Net AUC 按下述公式計(jì)算：

1.3.3 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的細(xì)胞抗氧化活性

1.3.3.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的毒性作用Caco-2 細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞以2×104cells/孔的密度接種于96 孔板中，分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，每個(gè)濃度6 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入80 μL 的培養(yǎng)基，試驗(yàn)組和對(duì)照組加入80 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h 后，空白組和對(duì)照組加入10 μL DMEM 無血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入10 μL 終質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1 mg/mL 的樣品溶液，繼續(xù)孵育12 h 后，各組均加入10 μL DMEM 無血清高糖培養(yǎng)基，孵育6 h 后，利用MTS 法[11]測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.3.2 H2O2誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞氧化損傷模型的建立 Caco-2 細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞以2×104細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中，分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，每個(gè)濃度6 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入80 μL 的培養(yǎng)基，試驗(yàn)組和對(duì)照組加入80 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h 后，各組均加入10 μL DMEM 無血清高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育12 h 后，空白組和對(duì)照組加入10 μL DMEM 無血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入10 μL 終濃度為 400，500，600，700，800，900 μmol/L 的H2O2溶液，孵育6 h 后，利用MTS 法[11]測(cè)定細(xì)胞存活率。選取細(xì)胞存活率50%所對(duì)應(yīng)的H2O2濃度為構(gòu)建Caco-2 細(xì)胞氧化損傷模型的最佳濃度。

1.3.3.3 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 Caco-2 細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞以2×104細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中，分別設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，每個(gè)濃度6 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入80 μL 的培養(yǎng)基，試驗(yàn)組和對(duì)照組加入80 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h 后，空白組和對(duì)照組加入10 μL DMEM 無血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入10 μL 終質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1 mg/mL 的樣品溶液，繼續(xù)孵育12 h 后，空白組和對(duì)照組加入10 μL DMEM 無血清高糖培養(yǎng)基，試驗(yàn)組加入10 μL 終濃度為700 μmol/L 的H2O2溶液，孵育6 h后，利用MTS 法[11]測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.4 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除作用 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的測(cè)定采用文獻(xiàn)中報(bào)道的DCFH-DA 熒光探針法[12]，并稍作修改。細(xì)胞孵育以及試驗(yàn)設(shè)置同1.3.3.3 節(jié)，經(jīng)過最后一步H2O2孵育6 h 后，將96 孔板中上清液吸棄，用PBS 清洗細(xì)胞后，每孔加入20 μL DCFH-DA 溶液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min 后，用PBS 清洗細(xì)胞3 次后加入DMEM，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 下的熒光強(qiáng)度。

1.3.5 體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）肽序列鑒定

1.3.5.2 肽的合成 通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的肽，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純度達(dá)到98%以上。

1.3.6 合成肽的體外抗氧化活性

1.3.6.1 合成肽的ABTS+·清除能力測(cè)定 方法同1.3.2.1 節(jié)。

1.3.6.2 合成肽的ORAC 測(cè)定 方法同1.3.2.2節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)3 次。用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性

2.1.1 ABTS+·清除能力測(cè)定 蛋白以及蛋白產(chǎn)物的ABTS 自由基清除活性結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，卵白蛋白及其消化產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基的清除能力均具有濃度依賴性，大小順序依次為：體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物<1 ku、體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物1～3 ku、體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物3～10 ku、卵白蛋白，說明卵白蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，其消化產(chǎn)物的ABTS 自由基清除活性均有不同程度的增強(qiáng)，這一結(jié)論與文獻(xiàn)中已有的報(bào)道相符[10-13]，說明蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，產(chǎn)生了新的具有抗氧化活性的肽段或氨基酸[14-15]?？梢园l(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量越小的組分表現(xiàn)出越強(qiáng)的ABTS 自由基清除活性，其中，分子質(zhì)量<1 ku的組分ABTS 自由基清除能力最強(qiáng)，與其它組分存在顯著性差異（P<0.05），最高濃度清除率達(dá)49.48%，F(xiàn)oh 等[16]以羅非魚為原料，得到蛋白水解物，同樣發(fā)現(xiàn)了分子質(zhì)量<1 ku 的組分清除ABTS自由基的能力最強(qiáng)，高于分子質(zhì)量<3 ku 的組分和分子質(zhì)量<5 ku 的組分。

圖1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的ABTS+·清除能力Fig.1 ABTS+·scavenging ability of ovalbumin and its digested products

2.1.2 ORAC 測(cè)定 蛋白以及蛋白產(chǎn)物的氧自由基吸收能力結(jié)果如圖2所示。ORAC 值最大的組分仍然為體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku），依次為體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（1～3 ku）、體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（5～10 ku）、卵白蛋白。其中體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）和體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（1～3 ku）的ORAC 值分別為1.21 μg/mL TE/μg/mL 和2.07 μg/mL TE/μg/mL，高于Trolox的ORAC 值（1 μg/mL TE/μg/mL）。這一結(jié)果與上述結(jié)果一致，說明經(jīng)過體外模擬胃腸道消化，卵白蛋白被酶解，釋放出新的抗氧化肽段，抗氧化肽段表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧自由基吸收能力，并且分子質(zhì)量越小的肽段，ORAC 值越大。這一結(jié)果與文獻(xiàn)中已有的報(bào)道相符：Vilcacundo 等[13]以藜麥蛋白為原料，經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，分子質(zhì)量<5 ku的組分ORAC 值高于分子質(zhì)量>5 ku 的組分。

圖2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的氧自由基吸收能力Fig.2 Oxygen free radical absorption capacity of ovalbumin and its digested products

2.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的細(xì)胞抗氧化活性

2.2.1 H2O2誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞氧化損傷模型的建立 不同濃度的H2O2對(duì)Caco-2 細(xì)胞存活率的影響如圖3所示。H2O2容易通過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高活性自由基，從而引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷或凋亡[18]。當(dāng)H2O2濃度由400 μmol/L 增加到900 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸降低，與未經(jīng)H2O2處理組（對(duì)照組）存在顯著性差異，當(dāng)H2O2濃度在700 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率為48%，約為對(duì)照組細(xì)胞存活率的50%，當(dāng)H2O2濃度在900 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率為13%，細(xì)胞氧化損傷過于嚴(yán)重，此時(shí)蛋白及其產(chǎn)物難以表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，綜合以上因素，選用700 μmol/L 的H2O2構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，探究體外模擬胃腸道消化的卵白蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞抗氧化活性。

圖3 H2O2 對(duì)Caco-2 細(xì)胞的損傷作用Fig.3 Damage effect of H2O2 on Caco-2 cells

2.2.2 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 卵白蛋白體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用結(jié)果如圖4所示。按照2.2.1 節(jié)構(gòu)建得到的細(xì)胞氧化損傷模型，H2O2處理組（損傷組）細(xì)胞存活率約為對(duì)照組的50%，與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05）。在H2O2處理細(xì)胞之前，用不同質(zhì)量濃度的肽（0.01，0.1，1 mg/mL）處理細(xì)胞，體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（3～10 ku）和體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（1～3 ku）細(xì)胞存活率與損傷組細(xì)胞沒有顯著性差異（P>0.05），對(duì)細(xì)胞沒有氧化損傷的預(yù)先保護(hù)作用。當(dāng)體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率與損傷組細(xì)胞沒有顯著性差異（P>0.05），隨著產(chǎn)物濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸提高，與損傷組存在顯著性差異（P<0.05），表明體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。值得注意的是：由于模型中所采用的細(xì)胞為人結(jié)腸癌細(xì)胞系（Caco-2 細(xì)胞），Caco-2 細(xì)胞經(jīng)分化后類似小腸細(xì)胞并可表達(dá)成熟的小腸細(xì)胞的特征，進(jìn)而該細(xì)胞被廣泛用于吸收模型研究。推測(cè)卵白蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，被Caco-2 細(xì)胞吸收，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用，從而提高細(xì)胞存活率。并且，在未經(jīng)H2O2處理、消化質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比表現(xiàn)為既不升高也不降低，與對(duì)照組無顯著性差異（P>0.05），表明消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞既沒有毒性作用，也不促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖4 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of ovalbumin digestion products on oxidative damage of Caco-2 cells

2.2.3 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用 DCF 的熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。如圖5所示，對(duì)照組熒光強(qiáng)度最低，即細(xì)胞內(nèi)ROS 含量最低，而損傷組細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增加，表明由于H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷作用，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)ROS 顯著增加。而經(jīng)過消化產(chǎn)物預(yù)先處理的試驗(yàn)組，除低質(zhì)量濃度（0.01 mg/mL）的體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（3～10 ku）外，均與損傷組存在顯著性差異（P<0.05），表明消化產(chǎn)物能夠減少細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生的過量ROS。值得注意的是，ROS 含量在低質(zhì)量濃度（0.01 mg/mL）和中質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL）組表現(xiàn)出濃度依賴性，而在中質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL）和高質(zhì)量濃度（1 mg/mL）組沒有表現(xiàn)出由于濃度產(chǎn)生的差異。研究表明，蛋白或肽段可能是由于刺激了細(xì)胞內(nèi)與抗氧化相關(guān)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗氧化作用[19-22]。那么，消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除在中、高濃度組無差異的原因可能是：一方面，由于肽被細(xì)胞吸收的量達(dá)到飽和；另一方面，由于通路蛋白受體飽和。如圖5所示，0.1 mg/mL 的體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組無顯著性差異，說明其已經(jīng)能將氧化損傷的Caco-2 細(xì)胞內(nèi)的ROS 清除到接近正常水平，具有較強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化活性。

圖5 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除作用Fig.5 Scavenging effects of ovalbumin digestion products on ROS in Caco-2 cells

2.3 體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）肽序列鑒定

從消化產(chǎn)物中抗氧化活性最強(qiáng)的組分中鑒定出3 條肽序列，二級(jí)質(zhì)譜圖如圖6所示。利用電噴霧軌道阱對(duì)掃描離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-Induced Dissociation，CID），在低能CID 下（10～200 eV），多肽鏈只在酰胺鍵處發(fā)生斷裂，因此主要產(chǎn)生b 離子和y 離子碎片[23]。采用文獻(xiàn)中報(bào)道的從頭測(cè)序的方法[24-27]，對(duì)多肽序列進(jìn)行鑒定，得到3 條四肽，分別為CFDV、CVSP 和MPFR，通過與已知卵白蛋白氨基酸序列對(duì)比，這3 條肽分別位于卵白蛋白12～15、383～386 和197～200 氨基酸殘基[28]。

圖6 CFDV、CVSP 和MPFR 的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of CFDV，CVSP and MPFR

2.4 合成肽的體外抗氧化活性

2.4.1 ABTS+·清除能力測(cè)定 3 種合成肽的ABTS 自由基清除活性如圖7所示。CFDV 和CVSP 表現(xiàn)出明顯的ABTS 自由基清除能力，并且具有濃度依賴性。與之相比，MPFR 則沒有明顯的ABTS 自由基清除能力，自由基清除率不足5%。與混合組分體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）相比，CFDV 和CVSP 在較低質(zhì)量濃度范圍（0.5，1，5 和10 μg/mL）就能表現(xiàn)混合組分相當(dāng)?shù)腁BTS 自由基清除能力，在質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)，這兩種肽的ABTS 自由基清除活性已經(jīng)接近100%，說明這兩種合成肽的ABTS 自由基清除能力高于混合組分體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（<1 ku）。研究表明，多肽的抗氧化活性與氨基酸組成有關(guān)，CFDV 和CVSP 的強(qiáng)ABTS+·清除能力可能與肽鏈N 端的半胱氨酸（C）有關(guān)[29]，半胱氨酸含有的硫醇基能直接與自由基反應(yīng)，從而增強(qiáng)了其清除自由基的能力[30]。

圖7 合成肽的ABTS+·清除能力Fig.7 ABTS+·scavenging ability of synthetic peptides

2.4.2 ORAC 測(cè)定 合成的3 種純肽的氧自由基吸收能力結(jié)果如圖8所示。不同于ABTS 自由基清除活性，3 種合成肽均表現(xiàn)出較強(qiáng)的氧自由基吸收能力，10 μg/mL 的CFDV、CVSP 和MPFR 的ORAC 值分別為1.87，1.28 和1.57 μg/mL TE/μg/mL，均高于同濃度的Trolox（1 μg/mL TE/μg/mL），說明，3 個(gè)多肽的體外抗氧化能力較強(qiáng)，這與多肽中含有Phe（F）、Val（V）以及Met（M）等疏水性氨基酸有關(guān)[32-33]。其中，MPFR 無明顯的ABTS 自由基清除能力，但是具有較強(qiáng)的ORAC 活性，這是由于這兩種測(cè)定體外抗氧化活性的方法原理的差異導(dǎo)致[34]。

圖8 合成肽的氧自由基吸收能力（ORAC）Fig.8 Oxygen free radical absorption capacity of synthetic peptides

3 結(jié)論

本文研究了經(jīng)體外模擬胃腸道消化的卵白蛋白產(chǎn)物的抗氧化性。發(fā)現(xiàn)體外模擬胃腸道消化能夠提高卵白蛋白ABTS+·清除活性和ORAC 值，并且組分分子質(zhì)量越小，其抗氧化性越強(qiáng)；分子質(zhì)量<1 ku 的產(chǎn)物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用；3 種組分均對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS 具有清除作用，并且具有濃度依賴性。從抗氧化活性最強(qiáng)的組分（分子質(zhì)量<1 ku 的產(chǎn)物）鑒定出3 條四肽序列，結(jié)果顯示CFDV 和CVSP 表現(xiàn)出明顯的ABTS+·清除能力，并且具有濃度依賴性；CFDV、CVSP 和MPFR 均表現(xiàn)出較強(qiáng)的氧自由基吸收能力。以上結(jié)果顯示，體外模擬胃腸道消化對(duì)卵白蛋白抗氧化活性的提高以及抗氧化活性肽段的釋放具有積極作用，卵白蛋白經(jīng)體內(nèi)消化后抗氧化活性變化規(guī)律及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。