急性應(yīng)激障礙向創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)展小鼠模型的制備

王子元，王 昊，黃 晏，周文霞

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

應(yīng)激障礙主要有急性應(yīng)激障礙（acute stress disorder，ASD）和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic disorder，PTSD）［1］。二者的臨床表現(xiàn)相似，均是嚴(yán)重的焦慮反應(yīng)和對創(chuàng)傷線索的重度恐懼［2-3］；二者的主要區(qū)別在于癥狀持續(xù)時間，1個月內(nèi)為ASD，超過1個月則為PTSD。早在17世紀(jì)，英國就有對PTSD癥狀的記載［4］，但直到越南戰(zhàn)爭后才引起人們的重視，并在由美國精神病學(xué)協(xié)會出版的《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第Ⅲ版（Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorder，DSM-Ⅲ）中正式收錄PTSD［5］。為了描述應(yīng)激后短時間內(nèi)部分人群出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)，并且確定急性創(chuàng)傷暴露患者中易發(fā)展為PTSD的高危人群［6］，DSM-Ⅳ第一次引入ASD的概念。在最新的DSM-Ⅴ中，進(jìn)一步明確了PTSD和ASD的診斷要點并細(xì)化了診斷依據(jù)。

有多項研究表明，ASD對PTSD具有中等強度的預(yù)測效度，即超過半數(shù)的ASD患者最終會發(fā)展并被確診為PTSD［7-12］。不過目前對于ASD發(fā)展為PTSD機(jī)制的了解并不透徹，臨床中也缺乏有效的防治藥物，僅有少部分研究顯示，創(chuàng)傷暴露人群在應(yīng)激后6 h內(nèi)給予氫化可的松可以減輕ASD和PTSD的核心癥狀［13］。目前藥物研究多采用單一的條件恐懼模型代表應(yīng)激障礙模型［14-15］，這并不符合應(yīng)激障礙的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，需要基于多個行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行綜合判定。現(xiàn)階段多數(shù)應(yīng)激障礙動物模型僅重點關(guān)注動物在PTSD階段的生理狀態(tài)變化［16-17］，建立一個采用多個行為學(xué)實驗綜合評價，觀察從ASD向PTSD發(fā)展過程中生理狀態(tài)變化的動物模型至關(guān)重要。

創(chuàng)傷經(jīng)歷是應(yīng)激障礙發(fā)生的必要條件，在動物模型中，采用電擊刺激模擬創(chuàng)傷經(jīng)歷具有易于精確調(diào)節(jié)應(yīng)激強度和時程的優(yōu)勢。本研究通過小鼠連續(xù)3 d行足底電擊模擬創(chuàng)傷經(jīng)歷，根據(jù)臨床診斷依據(jù)，通過曠場實驗、情景恐懼實驗以及創(chuàng)傷線索回避實驗?zāi)MASD和PTSD的焦慮樣行為、再體驗行為和主動回避行為?；贏SD和PTSD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以應(yīng)激后前3 d模擬ASD，以應(yīng)激后第28天模擬PTSD，觀察小鼠行為學(xué)表現(xiàn)，通過行為特征分析篩選出不同時期的ASD或PTSD個體，以及不同階段模型組小鼠的ASD和PTSD發(fā)生率，以期為ASD向PTSD的發(fā)展機(jī)制和防治藥物研究提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物和儀器

51只雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體重20～24 g（北京斯貝福生物技術(shù)有限公司），動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。小鼠自由攝食飲水，每日光照/黑暗各12 h。動物實驗室環(huán)境溫度24～26℃，相對濕度40%～60%。動物飼養(yǎng)和所有實驗方案均嚴(yán)格遵守軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

Anymaze動物視頻分析系統(tǒng)，美國Stoelting公司；小鼠自主活動性實驗裝置（30 cm×30 cm×30 cm）上海吉量軟件科技有限公司；Supermaze動物視頻分析系統(tǒng)，小鼠曠場裝置（40 cm×40 cm×40 cm）和電擊箱（52 cm×30 cm×55 cm），上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 實驗分組

剔除自主活動過高和過低的小鼠，具體方法為：實驗前將動物置于實驗房間，適應(yīng)環(huán)境30～60 min；實驗期間保持安靜；采用Anymaze軟件及視頻采集系統(tǒng)記錄每只小鼠在自主活動箱中20 min內(nèi)自發(fā)活動總距離；每只小鼠實驗完畢后，用50%乙醇擦拭箱體，避免氣味干擾。以20 min內(nèi)每只小鼠的活動總距離作為其自主活動性的指標(biāo)，按照±s（95%置信區(qū)間）的標(biāo)準(zhǔn)，將運動距離超過此范圍的小鼠剔除，然后按照體重和自主性活動半隨機(jī)化分為正常對照組和模型組，每組25～26只。對每只小鼠進(jìn)行編號。

1.3 足底電擊制備應(yīng)激模型

開始足底電擊的第3天為時間軸的0天（圖1）。小鼠結(jié)束適應(yīng)性飼養(yǎng)后第1天（圖1，-3 d）進(jìn)行自主活動性實驗，依據(jù)實驗數(shù)據(jù)篩選小鼠后，將小鼠隨機(jī)分為正常對照組和模型組。完成分組后第1天（圖1，-2 d）對實驗小鼠進(jìn)行足底電擊。足底電擊強度依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行微調(diào)［18］。實驗前將動物置于實驗房間，適應(yīng)環(huán)境30 min到1 h；實驗期間保持安靜。電擊箱中放入純黑色物體A，作為創(chuàng)傷事件相關(guān)的線索。小鼠放入電擊箱后適應(yīng)5 min，之后給予模型組小鼠足底電擊，強度為電流0.8 mA，每次持續(xù)10 s，間隔10 s，重復(fù)15次，連續(xù)電擊3 d；正常對照組小鼠放入電擊箱同等時間但不施加電擊。應(yīng)激后仍然保持一籠5～6只小鼠飼養(yǎng)。足底電擊后第1～3天為急性期，依次進(jìn)行曠場實驗、創(chuàng)傷線索回避實驗和情景恐懼實驗。足底電擊后第28～30天為慢性期，實驗進(jìn)行順序同急性期。電擊流程見圖1。

Fig.1 Schedule of behavioral experiment.Mice were placed in the experimental room before the experiment and acclimated to the environment for 30 min to 1 h.A solid black object A was placed in the shock box as a cue related to the traumatic event.The mice were placed in the shock box and acclimatized for 5 min，after which the model mice were given foot shocks with a current of 0.8 mA，each lasting 10 s，at 10 s intervals，and repeated 15 times for 3 d（-2 d-0 d）.The normal control mice were placed in the shock box for the same amount of time but no electric shocks were applied.OFT：open field test；TCAT：traumatic cue avoidance test；CF：contextual fear test.

1.4 曠場實驗檢測焦慮樣行為相關(guān)指標(biāo)

在完成足底電擊后的第1天和第28天進(jìn)行實驗，分別檢測活動總距離（overall distance），中心區(qū)域運動時間（time in center），中心區(qū)域運動距離（distance in center）和中心區(qū)域進(jìn)入次數(shù)（numbers of center entries）［19］。計算中心區(qū)域運動距離百分比，中心區(qū)域運動距離百分比（%）=中心區(qū)域運動距離/活動總距離×100%。實驗時，將小鼠面壁放在實驗箱一角，視頻記錄5 min內(nèi)小鼠在曠場實驗箱中的活動。曠場區(qū)域被等分為16格，其中中央4格定義為中心區(qū)，其余為外圍區(qū)，實驗時保證區(qū)域四角光線均勻。每只小鼠實驗結(jié)束后均用50%乙醇擦拭箱底，以免氣味干擾。

1.5 創(chuàng)傷線索回避實驗檢測小鼠探索物體的時間

在完成足底電擊后第2天和第29天進(jìn)行實驗。本實驗原理同埋球?qū)嶒炏嗨?，利用小鼠對新物體具有探索欲望的特性，但是物體作為創(chuàng)傷線索引起小鼠的恐懼情緒會阻止小鼠對物體進(jìn)行探索。先將作為創(chuàng)傷線索的純黑色物體A放入自主活動性實驗箱中（箱體中光強控制在30 lm），之后將小鼠貼壁放入實驗箱中自由探索10 min，當(dāng)小鼠面向物體，且鼻子主動嗅探物體或貼近物體周圍2 cm范圍即視為小鼠探索物體。記錄小鼠探索物體的時間，以反映小鼠的主動回避行為。每只小鼠實驗結(jié)束后，用50%乙醇擦拭箱體和物體，以消除前一只小鼠的氣味干擾。

1.6 情景恐懼實驗檢測小鼠僵直時間［20］

在完成應(yīng)激后第3天和第30天將小鼠重置電擊箱中10 min。電擊箱環(huán)境與小鼠應(yīng)激時完全一致，但不施加電擊刺激。記錄小鼠僵直時間（除呼吸引起的極其微弱的起伏外，身體一動不動定義為僵直狀態(tài)），以反映小鼠的再體驗行為。

1.7 行為特征分析

在行為特征分析中，選取曠場實驗中的中心區(qū)域運動距離百分比、創(chuàng)傷線索回避實驗中的探索物體時間和情景恐懼實驗中的僵直時間作為篩選指標(biāo)。模型組小鼠的數(shù)據(jù)與正常對照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。若中心區(qū)域運動距離百分比低于正常對照的（-1/2s）值，則表示小鼠出現(xiàn)焦慮樣癥狀；探索物體時間或僵直時間高于正常對照組（+1/2s）值，則表示小鼠出現(xiàn)再體驗癥狀或主動回避癥狀，當(dāng)小鼠同時具有上述3個癥狀判定為ASD或PTSD小鼠［17］。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 足底電擊對急性期和慢性期小鼠焦慮樣行為的影響和行為特征分析

曠場實驗結(jié)果表明，電擊結(jié)束后第1天，與正常對照組相比，模型組（n=26）的總活動距離明顯減少（P＜0.01）（圖2A），中心區(qū)域運動時間（P＜0.01）（圖2B）、中心區(qū)域進(jìn)入次數(shù)（P＜0.01）（圖2C）、中心區(qū)域運動距離（P＜0.01）（圖2D）和中心區(qū)域運動距離百分比（P＜0.01）（圖2E）顯著降低，提示電擊后第1天，即ASD階段小鼠出現(xiàn)了焦慮樣行為。至電擊后第28天，與正常對照組（n=25）相比，模型組總運動距離明顯減少（P＜0.05），提示探索行為異常未恢復(fù)；但其他指標(biāo)均已無明顯差異，提示電擊后28 d，即PTSD階段小鼠焦慮樣行為已基本消失，說明提示隨著時間的推移，小鼠的焦慮樣行為逐漸消退。

將電擊結(jié)束后第1天小鼠中心區(qū)域運動距離百分比進(jìn)行升序排列，并與電擊結(jié)束后第28天各小鼠相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)（圖2F）。結(jié)果顯示，正常對照組（r=0.31，P=0.12）（圖2G）小鼠在電擊結(jié)束后第1天和電擊結(jié)束后第28天中心區(qū)域運動距離百分比之間無明顯相關(guān)性，模型組（r=-0.08，P=0.68）（圖2H）不存在相關(guān)性。提示在ASD和PTSD階段小鼠所表現(xiàn)的焦慮樣行為無明顯關(guān)聯(lián)。

Fig.2 Effects of foot-shock on the related indexes of anxiety-like behavior in acute stress phase（the 1stday）and chronic stress phase（the 28thday）of mice by OFT.See Fig.1 for the legend.Percentage of distance in center（%）=distance in center/overall distance×100%.1stday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s percentage of distance in center（%）1 d after foot-shock；28thday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s percentage of distance in center（%）28 d after foot-shock.F：serial numbers from 1 to 25 were the mice of normal control group and 26-51 were the mice of model group.±s，n=25-26.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

行為學(xué)特征分析結(jié)果表明，正常對照組在電擊結(jié)束后第1天和第28天均有7只焦慮樣小鼠。模型組在電擊結(jié)束后第1天有20只焦慮樣小鼠，第28天減少到10只，其中有1只小鼠從無焦慮樣癥狀發(fā)展為有癥狀，有12只小鼠從有焦慮樣癥狀發(fā)展為無癥狀。

2.2 足底電擊對急性期和慢性期小鼠物體的探索時間的影響和行為特征分析

創(chuàng)傷線索回避實驗結(jié)果顯示，足底電擊結(jié)束后第2天，正常對照組小鼠物體的探索時間為（43±27）s，模型組為（20±21）s，明顯降低（P＜0.01），提示產(chǎn)生明顯的主動回避行為。電擊結(jié)束后第29天，正常對照組小鼠物體的探索時間為（48±21）s，模型組為（17±19）s，明顯降低（P＜0.01），提示回避行為依舊存在（圖3A）。

將電擊結(jié)束后第2天小鼠探索時間進(jìn)行升序排列，并與應(yīng)激后29天各小鼠相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)（圖3B），分析小鼠電擊結(jié)束后第2天和第29天探索時間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，正常對照組小鼠（r=0.09，P=0.66）（圖3C）電擊結(jié)束后第1天的探索時間同第29天無明顯相關(guān)性，而模型組小鼠（r=0.50，P＜0.01）（圖3D）呈現(xiàn)中等強度的相關(guān)性，提示在ASD和PTSD階段小鼠所表現(xiàn)的主動回避行為呈正相關(guān)。

Fig.3 Effects of foot-shock on the exploration time in acute stress phase（the 2ndday）and chronic stress phase（the 29thday）of mice by TCAT.See Fig.1 for the lengend.2ndday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s exploring time 2 d after foot-shock；29thday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s exploring time 29 d after foot-shock.±s，n=25-26.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

行為學(xué)特征分析結(jié)果表明，正常對照組在電擊結(jié)束后第2天和應(yīng)激后第29天分別有8只和7只小鼠出現(xiàn)回避癥狀。模型組有19只小鼠在電擊結(jié)束后第2天出現(xiàn)回避癥狀，在第29天上升到23只，其中4只從電擊結(jié)束后第2天無回避癥狀發(fā)展到出現(xiàn)回避癥狀。

2.3 足底電擊對急性期和慢性期小鼠僵直時間的影響和行為特征分析

情景恐懼實驗結(jié)果顯示，電擊結(jié)束后第3天，正常對照組小鼠的僵直時間為（82±58）s，模型組為（202±82）s，明顯升高（P＜0.01），提示產(chǎn)生明顯的再體驗癥狀。電擊結(jié)束后第30天，正常對照組小鼠的僵直時間為（106±44）s，模型組為（142±71）s，明顯升高（P＜0.05），提示再體驗行為依舊存在（圖4A）。

將應(yīng)激后第3天小鼠僵直時間進(jìn)行升序排列，并與應(yīng)激后30 d各小鼠相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)（圖4B）。進(jìn)而分析應(yīng)激后第3天和第30天僵直時間的相關(guān)性，旨在了解小鼠再體驗行為隨時間推移的發(fā)展變化情況。結(jié)果顯示對照組小鼠（r=0.11，P=0.59）（圖4C）應(yīng)激后第3天的探索時間同第30天無明顯相關(guān)性，而模型組小鼠（r=0.72，P＜0.01）（圖4D）呈現(xiàn)強相關(guān)性，提示在ASD和PTSD階段小鼠所表現(xiàn)的再體驗行為呈正相關(guān)。

行為學(xué)特征分析結(jié)果顯示，正常對照組和模型組在應(yīng)激后第3天分別有5只和24只小鼠出現(xiàn)再體驗癥狀；在應(yīng)激后第30天，對照組和模型組中出現(xiàn)再體驗癥狀的小鼠數(shù)量分別為8只和14只。模型組中有10只小鼠從有再體驗癥狀發(fā)展到無癥狀；無小鼠從無癥狀發(fā)展到出現(xiàn)癥狀。

2.4 小鼠ASD、PTSD發(fā)生率及ASD向PTSD發(fā)展分析

行為特征分析小鼠ASD和PTSD患病率結(jié)果顯示，正常對照組小鼠（n=25）在急性期和慢性期的患病率分別為4.0%和8.0%。模型組小鼠（n=26）在急性期的患病率達(dá)到57.7%，隨時間推移在30 d后下降到30.8%。應(yīng)激后急性期有1只模型組小鼠僅出現(xiàn)一種癥狀，同時這只小鼠并沒有發(fā)展為PTSD；模型組小鼠中有10只在急性期出現(xiàn)2種癥狀，其中有2只發(fā)展為PTSD；有15只模型組小鼠在急性期出現(xiàn)全部3種癥狀，即患有ASD，其中6只發(fā)展為PTSD。提示在應(yīng)激初期患有ASD的小鼠可能更易發(fā)展為PTSD。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，模型小鼠在急性應(yīng)激期表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，慢性應(yīng)激期其焦慮樣行為顯著恢復(fù)，這種變化趨勢與文獻(xiàn)報道的應(yīng)激動物模型和臨床研究結(jié)果一致［22-23］。在情景恐懼和創(chuàng)傷線索回避方面，模型動物在急性期也表現(xiàn)出明顯的情景恐懼和主動回避行為，且在慢性期無明顯緩解，這也與已有研究的變化趨勢一致［24-25］。在臨床中，隨著時間的推移創(chuàng)傷暴露患者癥狀的變化情況一直是研究的重點。通過相關(guān)性分析可以看出，應(yīng)激后模型小鼠個體主動回避和再體驗癥狀在急、慢性期的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)較強的正相關(guān)性，而焦慮無明顯相關(guān)性，說明應(yīng)激后個體在急性期主動回避和再體驗癥狀的嚴(yán)重程度可以預(yù)測慢性期癥狀的嚴(yán)重程度。作為創(chuàng)傷記憶的相關(guān)癥狀，個體在應(yīng)激后急性期呈現(xiàn)出嚴(yán)重的主動回避或再體驗癥狀會持續(xù)至慢性期、不易消退，這與創(chuàng)傷記憶難以消除是PTSD核心問題的現(xiàn)有主流理論相符［26］。這也提示對于應(yīng)激障礙的臨床干預(yù)，應(yīng)該在創(chuàng)傷暴露后早期重點關(guān)注出現(xiàn)創(chuàng)傷記憶相關(guān)癥狀的患者，因為其癥狀長期持續(xù)的可能性更高。雖然，從整體上看模型動物在負(fù)性情緒、再體驗癥狀以及主動回避等行為種均表現(xiàn)出一致的變化趨勢并與已有研究結(jié)果一致，但是動物個體在暴露于應(yīng)激事件后可呈現(xiàn)出不同程度的創(chuàng)傷反應(yīng)［27-28］。所以，無法直接用群體平均值判定某一動物應(yīng)激障礙的發(fā)病情況，要判定個體動物的發(fā)病情況需要對動物應(yīng)激后個體行為指標(biāo)進(jìn)行分析。

目前，用于動物應(yīng)激后個體行為學(xué)篩選的方法主要有2種：“cut-off behavioral criteria（CBC）”和“行為特征分析”。CBC是通過選擇特定的標(biāo)準(zhǔn)來篩選行為學(xué)中表現(xiàn)極端的個體。如Cohen等［29］用高架十字迷宮和聽覺驚跳反射2個行為學(xué)實驗，選取開臂進(jìn)入次數(shù)為0和平均驚嚇幅度大于1200個單位作為CBC，同時符合2項標(biāo)準(zhǔn)的大鼠即為“適應(yīng)不良”。結(jié)果顯示，隨著時間的推移，應(yīng)激適應(yīng)不良的患病率從應(yīng)激后第1天的90%下降到7 d后的25%，并保持到應(yīng)激后第30天不變。使用CBC進(jìn)行篩選能夠進(jìn)一步提升模型的表觀效度，但CBC的標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)激群體中個體對應(yīng)激反應(yīng)的偏差，而臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)是基于正常人群的偏差［30］。為了更加接近臨床的診斷，有多個研究者［17，31-32］對CBC法進(jìn)行了改良，開發(fā)了一種新的篩選方法——行為特征分析。行為特征分析是將未應(yīng)激的對照組的行為表現(xiàn)作為定義界限的基礎(chǔ)，確定的截止標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)保證多數(shù)正常動物處于正常范圍，然后基于截止標(biāo)準(zhǔn)對所有組別的動物進(jìn)行分析，把偏離截止標(biāo)準(zhǔn)的動物定義為“患病”個體。此外，行為特征分析還需要同時采用多個行為學(xué)指標(biāo)，被定義為行為學(xué)極端個體的動物需要在多個參數(shù)中均超過臨界點，而不僅僅是一個參數(shù)。同時，行為特征分析的原則是以對照組作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用此方法可以消除多次行為學(xué)實驗本身對動物的影響。

行為特征分析結(jié)果顯示，模型組小鼠急性應(yīng)激期和慢性應(yīng)激期的患病率分別約有57.7%和30.8%，這個患病率的時間序列特征與Bonanno等［32］使用CBC法后的發(fā)現(xiàn)類似，也同臨床數(shù)據(jù)具有一致性。臨床數(shù)據(jù)顯示，在應(yīng)激后被診斷為ASD的患者中有超過50%最終發(fā)展為PTSD，而在初期不符合ASD診斷依據(jù)的人群只有大約10%發(fā)展為PTSD［8］。在研究中，急性期同時符合3個ASD癥狀的15只小鼠中有6只在慢性期被診斷為PTSD，占比40%；急性期符合2個ASD癥狀的10只小鼠中只有2只發(fā)展為PTSD，占比20%；急性應(yīng)激期符合1個ASD癥狀標(biāo)準(zhǔn)的只有1只小鼠，在慢性應(yīng)激期沒有被診斷為PTSD。本研究結(jié)果提示，應(yīng)激后早期患有ASD的小鼠發(fā)展為PTSD的概率高于沒有ASD的小鼠，這一現(xiàn)象也與臨床數(shù)據(jù)相符。

綜上所述，本研究成功建立了連續(xù)3 d足底電擊致小鼠ASD向PTSD發(fā)展的模型。此模型較好地模擬了ASD和PTSD的臨床癥狀、患病率和不同時期的狀態(tài)變化，此模型有可能用于ASD向PTSD發(fā)病機(jī)制的研究和防治應(yīng)激障礙的藥物篩選評價。