PinX1調(diào)控PI3K/Akt信號通路影響口腔鱗癌HSC6細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡

鄧璐 曾利偉 焦紀(jì)蘭 江輝

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤的第八位，具有快速增長、侵襲性強和易轉(zhuǎn)移等特性[1]；臨床上，手術(shù)、放療和化療是口腔鱗癌的主要治療手段，但患者5年生存率僅在65%左右[2]。因此，深入探討口腔鱗癌的發(fā)病機制尋找新的治療策略是有必要的。人Pin2結(jié)合蛋白X1(PIN2-interacting protein X1，PinX1)是一種端粒調(diào)控基因，定位于人8p23染色體上[3]。研究[4-6]顯示，PinX1在非小細(xì)胞肺癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤中常見低表達(dá)，與腫瘤臨床病理特征和不良預(yù)后密切相關(guān)。且PinX1可影響細(xì)胞增殖、侵襲能力和凋亡水平發(fā)揮抑癌作用?？谇击[癌組織PinX1表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。然而，PinX1在口腔鱗癌中的調(diào)控作用未見報道。因此，本研究通過開展體外細(xì)胞實驗，通過觀察PinX1對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞功能的影響及調(diào)控機制以揭示PinX1在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料和儀器

人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞株HOEC(上海雅吉生物公司)；口腔鱗癌細(xì)胞株HSC6(上海通派生物公司)；胎牛血清、青鏈霉素混合液(大連寶生物公司)；低糖改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、高糖培養(yǎng)基(roswell park memorial institute，RPMI)-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；PinX1、增殖核抗原Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphorylation phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(protein kinase B,p-Akt)、PI3K、AKT和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Santa Cruz公司，美國)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)。脂質(zhì)體2000(廣州銳博生物公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)；胰蛋白酶、蛋白提取試劑盒、細(xì)胞計數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)；pcDNA3.1-PinX1重組質(zhì)粒(Invitrogen公司，美國)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERAcell 240i，Heraeus公司，德國)；酶標(biāo)儀(iMark，Bio-Rad公司，美國)；倒置熒光顯微鏡(TE2000-E，Nikon公司，日本)；流式細(xì)胞儀(Cyto FLEX，Beckman公司，美國)；凝膠掃描系統(tǒng)(GelDoc-It 310，UVP公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 IHC法檢測PinX1在OSCC組織中表達(dá) 收集手術(shù)切除的OSCC組織及癌旁組織樣本各30 例，IHC方法檢測其中PinX1的表達(dá)，比較2 組樣本的表達(dá)陽性率。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在溫度為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和濕度飽和的環(huán)境下使用含1%青鏈霉雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HOEC細(xì)胞；相同環(huán)境下采用添加有1%青鏈霉雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HSC6細(xì)胞。

1.2.3 實驗分組與HSC6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期HSC6細(xì)胞(2×105個/孔)接種至6 孔細(xì)胞板上，置于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為對照組(未轉(zhuǎn)染)、空載體組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體)、PinX1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PinX1重組質(zhì)粒)和PinX1+IGF-1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PinX1重組質(zhì)粒后，用100 ng/ml的IGF-1處理20 min)，每組設(shè)置3 個平行孔。待細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合度時，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟根據(jù)實驗分組將pcDNA3.1-PinX1重組質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染至HSC6細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染5 h后更換培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，并采用免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中PinX1蛋白的表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 CCK-8法檢測HSC6細(xì)胞增殖 將PinX1+IGF-1組、PinX1組、空載體組和未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞以每孔105個接種至96 孔細(xì)胞板上，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)1～4 d。培養(yǎng)至所需時間后，參照CCK-8試劑盒說明書上酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞的光密度值，其中檢測波長為450 nm。重復(fù)檢測3 次。

1.2.5 Transwell小室檢測HSC6細(xì)胞侵襲 將基質(zhì)膠稀釋為1 mg/ml，取60 μL濃度平鋪在Transwell小室上下室間的聚碳酸酯微孔膜(孔徑為8 μm)，室溫下自然融合。以無血清培養(yǎng)基調(diào)整PinX1+IGF-1組、PinX1組、空載體組、對照組細(xì)胞濃度為104個/mL。在Transwell小室上室和下室內(nèi)分別加入細(xì)胞懸液200 μL/孔，含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL/孔，且每組設(shè)置3 個平行孔。置于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，小心拭去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定聚碳酸酯微孔膜下表面附著細(xì)胞30 min，再以0.1%結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計各組中的穿膜細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測HSC6細(xì)胞凋亡 收集PinX1+IGF-1組、PinX1組、空載體組、對照組細(xì)胞，每組設(shè)3 個平行孔。經(jīng)磷酸緩沖液洗滌2 次后，參照凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行凋亡檢測。實驗重復(fù)3 次。

1.2.7 免疫印跡法檢測HSC6細(xì)胞中PinX1、Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達(dá) 向HOEC細(xì)胞、各組HSC6細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。變性蛋白，取50 μg加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離。蛋白分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。先用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，再以一抗工作液(PinX1 1∶100、Ki67 1∶500、MMP-9 1∶800、Bcl-2 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000)在4 ℃下孵育24 h，最后以二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光劑，暗室顯影曝光。采用凝膠掃描系統(tǒng)分析待測細(xì)胞中Ki67、PinX1、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)量。實驗重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 PinX1在口腔鱗癌組織和HSC6細(xì)胞中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效果

PinX1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)見圖 1?？谇击[癌組織PinX1蛋白陽性表達(dá)率為13.33%，癌旁組織為83.33%(P<0.05)。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，人口腔鱗癌HSC6細(xì)胞中PinX1蛋白的表達(dá)水平(0.24±0.03)明顯低于人正?？谇簧掀OEC細(xì)胞(0.68±0.05)(圖 2A)；轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中PinX1蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，PinX1組細(xì)胞中PinX1蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而空載體組細(xì)胞中PinX1蛋白的表達(dá)水平無明顯改變(P>0.05)(圖 2B，表 1)。

2.2 PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞增殖的影響

空載組從1 d至4 d細(xì)胞的增殖活力與對照組直接無明顯差異(P>0.05)，但PinX1組從2 d開始細(xì)胞增殖活力較對照組明顯降低(P<0.05)(表 2)。

圖 1 PinX1在口腔鱗癌和癌旁組織中的表達(dá) (IHC, ×200)

圖 2 PinX1蛋白在HSC6細(xì)胞中的表達(dá)

表 1 各組細(xì)胞中PinX1蛋白表達(dá)水平的比較 (相對灰度值，

表 2 PinX1過表達(dá)對HSC6細(xì)胞450 nm處光密度值的影響

2.3 PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞侵襲的影響

圖 3和表 3結(jié)果顯示，空載體組中侵襲細(xì)胞數(shù)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，但PinX1組中侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組明顯降低(P<0.05)。

圖 3 Transwell實驗檢測各組細(xì)胞侵襲能力

2.4 PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞凋亡的影響

圖 4和表 3結(jié)果顯示，與對照組相比，PinX1組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)，但空載體組與對照組比較細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P>0.05)。

圖 4 流式細(xì)胞儀檢測PinX1過表達(dá)對HSC6細(xì)胞凋亡的影響

表 3 PinX1過表達(dá)對HSC6細(xì)胞侵襲和凋亡的影響

2.5 PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖 5和表 4結(jié)果顯示，與對照組相比，PinX1組細(xì)胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P>0.05)，但空載體組中這3 項指標(biāo)無明顯改變(P>0.05)。

2.6 PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路表達(dá)的影響

與對照組比較，PinX1組HSC6細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低，但空載體組中p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)無顯著變化(表 5)。

圖 5 免疫印跡法檢測各組HSC6細(xì)胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達(dá)

表 4 PinX1過表達(dá)對HSC6細(xì)胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表 5 PinX1過表達(dá)對HSC6細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路表達(dá)的影響

2.7 激活PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

與PinX1組比較，PinX1+IGF-1組HSC6細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)升高(表 6)；與PinX1組比較，PinX1+IGF-1組HSC6細(xì)胞凋亡率降低，侵襲細(xì)胞數(shù)升高，從2 d開始HSC6細(xì)胞增殖活力升高，Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(表 7～8)。

表 6 IGF-1對HSC6細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路激活的影響

表 7 激活PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)PinX1過表達(dá)對HSC6細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響

表 8 激活PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)PinX1過表達(dá)對口腔鱗癌HSC6細(xì)胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

端粒是染色體末端一種DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，在維持基因組穩(wěn)定性和調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用；端粒酶可維持端粒穩(wěn)定性，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵酶[7]。PinX1是一種端粒酶強效抑制劑，其在腫瘤中的作用逐漸引起關(guān)注，F(xiàn)eng等[8]發(fā)現(xiàn)，PinX1在基底樣乳腺癌組織中異常低表達(dá)，且與腫瘤組織學(xué)分級、侵襲性密切相關(guān)；PinX1的過度表達(dá)抑制了基底樣乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而Kang等[9]指出，PinX1在間變性甲狀腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于乳頭狀甲狀腺癌，促進(jìn)甲狀腺癌的細(xì)胞增殖、遷移和分化進(jìn)程，發(fā)揮著類似致癌基因的作用。PinX1在不同類型的癌癥中發(fā)揮不同的作用。本研究觀察到口腔鱗癌HSC6細(xì)胞PinX1表達(dá)水平較正?？谇簧掀OEC細(xì)胞明顯降低，而成功上調(diào)PinX1表達(dá)明顯增強HSC6細(xì)胞凋亡能力，減弱增殖、侵襲能力。這提示PinX1可通過調(diào)控癌細(xì)胞生物學(xué)功能在口腔鱗癌中發(fā)揮著重要作用。

Ki67是一種細(xì)胞增殖核蛋白，常被作為口腔鱗癌細(xì)胞增殖的標(biāo)記物[10]；MMP-9是維持細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑的動態(tài)平衡中的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，與口腔鱗癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]；在細(xì)胞凋亡研究中Bcl-2是最受重視的癌基因之一，其在口腔鱗癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的抑制作用[12]。Liu等[13]研究指出，膀胱尿路上皮癌組織中PinX1表達(dá)顯著下調(diào)，且與Ki67表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。趙楊等[14]發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)的PinXl可能通過引起MMP-9通路激活促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。申聰香等[15]指出，PinX1可通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)提高鼻咽癌細(xì)胞對順鉑的化療敏感性。本研究進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PinX1可降低口腔鱗癌HSC6細(xì)胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表達(dá)，這與功能分析實驗結(jié)果相一致。提示PinX1在口腔鱗癌中發(fā)揮抑癌基因作用。

PI3K/AKT作為一種重要細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其已被證實在口腔鱗癌等多種類型惡性腫瘤激活，參與腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。抑制PI3K/AKT信號通路可降低口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[17]。本研究顯示，PinX1可降低p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平，阻斷PI3K/AKT信號通路，而使用IGF-1激活PI3K/AKT信號通路則逆轉(zhuǎn)過表達(dá)PinX1對HSC6細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡以及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。提示，PinX1通過抑制PI3K/AKT信號通路在口腔鱗癌中發(fā)揮作用。

總之，PinX1通過抑制PI3K/AKT信號通路可抑制口腔鱗癌HSC6細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該結(jié)果豐富了口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，為PinX1作為口腔鱗癌治療的新靶點提供了參考依據(jù)。