細胞膜電位對大鼠BMMSCs基本生物學行為影響的研究

李沛漢 郎凱 劉婧 蒙萌 宋文

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是組織工程領域研究最為經典的種子細胞，具有體外擴增、多向分化等潛能，被廣泛地應用于各種組織再生的研究[1]。多種因素均可影響B(tài)MMSCs的細胞學行為，主要有物理因素、化學刺激以及生物因子刺激等，例如特定的納米形貌[2]、Sr離子[3]、BMP因子[4]等刺激均可誘導BMMSCs向成骨方向分化，這些特點為利用BMMSCs促進骨組織再生的研究提供了重要策略。細胞膜電位是細胞最基礎的電生理參數之一，最初在可興奮細胞神經元、心肌細胞等被完整闡釋，其基本概念為細胞膜上的Na+-K+泵持續(xù)維持了細胞內高K+濃度和細胞外高Na+濃度，為對抗離子濃度梯度的化學擴散趨勢，細胞形成一個跨膜的負電位，使得電力作用與化學濃度梯度相平衡。隨著研究的深入，膜電位在許多不可興奮細胞中的作用也逐漸受到重視，其中就包括了BMMSCs[5]。已有研究證實人BMMSCs在分化過程中膜電位差增加，在去極化或超極化處理后分別會抑制/促進其分化[6-7]。然而目前國內尚缺乏針對膜電位對BMMSCs行為影響的系統(tǒng)性研究，且其調控機制尚不明確。本實驗觀察了去極化和超極化對BMMSCs遷移、增殖以及分化的影響，分析了胞漿鈣離子濃度的變化，初步證實了膜電位在BMMSCs基本生物學行為中有重要作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SD大鼠(第四軍醫(yī)大學動物中心)；α-MEM、胎牛血清、雙抗、含EDTA胰蛋白酶、PBS、HBSS(Hyclone，美國)；CCK8、DiSBAC、Fluo-8 AM胞漿鈣離子染色試劑盒(Invitrogen，美國)；抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松(西安沃爾森)；烏本苷(ouabain)、二氮嗪(diazoxide)、茜素紅、氯化十六烷基吡啶(Sigma-Aldrich，美國)。

1.2 細胞分離培養(yǎng)

采用全骨髓貼壁法進行大鼠BMMSCs的分離培養(yǎng)。選擇約1 周齡的雄性SD大鼠，脫頸處死后在75%酒精中浸泡15 min消毒；在超凈工作臺內PBS浸潤下進行四肢長骨的分離，剪開兩端后用注射器吸取α-MEM沖洗骨髓腔，收集全部產物進行離心，將沉淀物用α-MEM+20%胎牛血清+0.1%雙抗進行貼壁培養(yǎng)。約5 d后進行初次換液，待細胞密度至～80%行胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)液血清降低至10%；約3～5代后細胞純度較好，進行后續(xù)實驗觀察。

1.3 細胞膜電位染色

依據前期文獻報道采用電壓敏感性染料DiSBAC對膜電位進行半定量分析[6]。將細胞按2 萬/孔密度接種到24 孔板內，在常規(guī)培養(yǎng)液內增值3 d，隨后換成成骨誘導液誘導3 d，即在常規(guī)培養(yǎng)液基礎上再加入抗壞血酸(50 μg/ml)、β-甘油磷酸鈉(10 mmol/L)和地塞米松(100 nmol/L)。在連續(xù)6 d內監(jiān)測細胞膜電位的變化，即在HBSS中稀釋DiSBAC母液至工作濃度，與活細胞在37 ℃孵育5 min后直接進行熒光顯微鏡拍照，固定曝光時間在77 ms，對拍攝的照片采用Image J軟件進行熒光強度分析。

1.4 劃痕試驗

采用劃痕試驗進行細胞遷移的觀察。將細胞按4 萬/孔密度接種在24 孔板內適應24 h后使細胞達到合適密度，采用1 mL槍頭在板底縱橫兩個方向劃出寬度約5 mm的十字交叉無細胞區(qū)域，立刻進行顯微鏡拍照。分別在培養(yǎng)液中不同物質確定試驗分組：無添加為空白組、添加烏本苷(ouabain，10 nmol/L)為去極化組、添加二氮嗪(diazoxide,10 μmol/L)為超極化組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次進行顯微鏡拍照。

1.5 細胞增殖

細胞接種培養(yǎng)及分組同“1.4”。在處理24 h后將培養(yǎng)液換成CCK8工作液(常規(guī)培養(yǎng)基稀釋后的CCK8母液)，37 ℃繼續(xù)孵育3 h后取出，小心吸取上清液轉移至96 孔板中在450 nm處檢測吸光度。

1.6 茜素紅染色

細胞接種培養(yǎng)同“1.4”，在進行成骨誘導時在成骨誘導液內分別添加不同物質確定試驗分組：無添加為空白組、添加烏本苷(10 nmol/L)為去極化組、添加二氮嗪(10 μmol/L)為超極化組。持續(xù)誘導21 d后將細胞固定在4%多聚甲醛中，室溫行茜素紅染色10 min，去離子水漂洗后顯微鏡拍照；隨后將染色用氯化十六烷基吡啶溶解，于580 nm處測定吸光度進行染色半定量分析。

1.7 胞漿鈣離子染色

細胞接種與培養(yǎng)及分組同“1.4”，密度減為2 萬/孔，處理24 h后將細胞孵育在含F(xiàn)luo-8 AM(5 μmol/L)與Pluronic F-127(0.02%)的混合工作液α-MEM中，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 細胞增殖分化過程中膜電位變化

采用電壓依賴性染料染色可展現(xiàn)出細胞跨膜電位的變化，細胞在常規(guī)培養(yǎng)基中連續(xù)增殖3 d，換成成骨誘導液分化3 d，采用電壓敏感性染料DiSBAC染色進行熒光顯微鏡拍照,在細胞增殖階段可見細胞數量顯著增加，但平均細胞的熒光強度未見顯著差異，提示膜電位變化不大；而當換成成骨誘導液后，細胞熒光強度急劇增加，并逐漸維持在較高水平，表明細胞在成骨分化過程中細胞跨膜電位顯著增加，發(fā)生了超極化現(xiàn)象(圖 1)；半定量分析可見在增殖階段膜電位變化不顯著，添加成骨誘導液熒光強度增強40 倍以上(圖 2)。

2.2 細胞膜電位對細胞遷移的影響

劃痕試驗評估BMMSCs的遷移速率可見，未處理狀態(tài)下經歷24 h細胞劃痕部分得到修復，在去極化處理后劃痕愈合顯著增加，而在超極化處理后僅可見散在的細胞分布在劃痕區(qū)域內(圖 3)；半定量分析可見在細胞去極化處理后遷移速率增加約1 倍，當細胞超極化處理時，遷移速率下降約1 半(圖 4)。

圖 2 相對細胞平均熒光強度

2.3 細胞膜電位對細胞增殖的影響

采用CCK8測試分析不同處理后細胞活力變化，可見在細胞去極化處理后增殖活性顯著增加約3 倍，而在超極化處理后細胞增殖活力受到顯著抑制一半以上(圖 5)。

2.4 細胞膜電位對細胞成骨分化的影響

通過茜素紅染色分析細胞成骨分化能力可見與未處理組細胞相比，細胞去極化處理后鈣結節(jié)形成有所減少，而在超極化處理后鈣結節(jié)染色則顯著增多；半定量分析可見在去極化處理后細胞分化收到顯著抑制，與之相反，去極化處理后分化能力提升了1 倍以上(圖 6)。

圖 3 劃痕試驗

圖 4 細胞遷移速率 圖 5 細胞增殖

2.5 胞漿鈣離子濃度變化

胞漿鈣離子濃度變化是與細胞膜電位變化最為相關的因素之一，通過胞漿鈣離子染色觀察,去極化處理后較未處理組胞漿熒光強度顯著增加，而超極化處理后則顯著降低；半定量分析可見去極化處理后胞漿鈣離子濃度上調約4 倍，而超極化則下降達一半以上(圖 7)。

圖 6 成骨分化(茜素紅染色)

圖 6 胞漿鈣離子檢測

3 討 論

細胞電生理活動是最基礎的特征之一，越來越多的研究證實，除了神經元等可興奮細胞外，不可興奮細胞的電生理特性也參與了細胞多種重要的生理活動。BMMSCs是組織工程中極為重要的種子細胞來源，其電生理行為也受到了一定關注，然而目前仍未有廣泛的研究探索，可能是一個被忽略的重要調控環(huán)節(jié)。

本研究發(fā)現(xiàn)在早期的增殖過程中BMMSCs的跨膜電位未發(fā)生顯著變化，這與前期報道的腫瘤細胞或細菌在增殖中會發(fā)生的電位變化不一致[8-9]，且Bhavsar等[10]在大鼠BMMSCs中也觀測到了增殖對應的特征性膜電位變化，并提出了其潛在的調控意義。這一方面可能是觀測時間跨度不足，另一方面可能BMMSCs的膜電位與培養(yǎng)液中的成分關系十分密切，因為一旦換成成骨誘導液后跨膜電位發(fā)生急劇性的增加，此后一直保持在較高的水平，表明成骨誘導液中的成分可能引起了細胞膜離子通道的大幅度變化。

隨后研究發(fā)現(xiàn)采用烏本苷對BMMSCs去極化處理后細胞遷移速率和增殖活性顯著增強；與之相反，采用二氮嗪誘導細胞超極化反應后細胞遷移速率和增殖能力受到顯著抑制，即去極化可激活細胞增殖信號，促進細胞的增殖和遷移行為，而超極化則與之相反，這與已有的相關報道相一致。例如在腫瘤細胞的研究中證實，跨膜電位是控制腫瘤細胞生長增殖的重要參數之一，一方面在誘導腫瘤形成過程中細胞膜電位表現(xiàn)為去極化特征，另一方面在誘導細胞超極化后可顯著抑制腫瘤形成[8]；在人BMMSCs的觀測中也證實，增殖與K+的含量變化關系密切，而K+則是維系膜電位的基礎[11]。在誘導BMMSCs發(fā)生去極化或超極化后可分別抑制和促進其成骨分化能力，與前期的文獻報道結論一致[6]，這提示細胞膜電位可能作為一種全新的干預靶點實現(xiàn)對BMMSCs成骨分化的調控，對誘導骨組織工程再生提供了新思路。

然而目前對于BMMSCs的電生理活動研究尚未有廣泛開展，膜電位對于其行為的調控機理尚不完全明確。可推測鈣離子可能是膜電位變化調控細胞行為的關鍵橋梁，一方面鈣離子的平衡與細胞電生理活動密切相關[12]，本研究也發(fā)現(xiàn)在細胞發(fā)生去極化或超極化后，相應胞漿鈣離子濃度顯著上升或下降；另一方面，鈣離子信號介導了細胞遷移、分化等多種生理活動[13]。然而也有研究認為鈣離子信號是膜電位調控細胞行為中的次要方面，發(fā)揮最關鍵作用的是磷酸根離子信號或者與膜電位直接聯(lián)系的鉀離子濃度變化引起的細胞行為改變[11,14]。無論如何，這方面的研究還十分欠缺，有待于更進一步的深入探索。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs的膜電位對細胞行為具有重要的調控意義，即誘導BMMSCs發(fā)生去極化后細胞的遷移和增殖能力顯著增強，而成骨分化能力受到抑制；反之，誘導細胞超極化后其遷移、增殖能力顯著抑制，而成骨分化能力顯著提升。這種調控現(xiàn)象可能與膜電位誘導的胞漿鈣離子濃度變化有關，更進一步的調控機理尚有待分析。這些發(fā)現(xiàn)為組織工程領域誘導BMMSCs特定生物學功能提供了全新的干預方向。