乙酰肝素酶通過轉錄因子Runx2調控多發(fā)性骨髓瘤細胞功能

潘倩影 水 煒 牛媛媛 張常然

多發(fā)性骨髓瘤 (multiple myeloma，MM)是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以克隆性的漿細胞在骨髓中異常增生為特征[1]。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是一種存在于哺乳動物體內的內源性β-D-葡萄糖醛酸酶，其可以切割細胞表面的乙酰肝素鏈，使連接在乙酰肝素鏈上的具有生物學活性的細胞因子，如FGF-2、HGF、TGF-β、PDGF、KGF等釋放到骨髓微環(huán)境中，通過與骨髓微環(huán)境中的各種細胞表面受體結合，調節(jié)各種細胞功能[2]。HPSE被發(fā)現(xiàn)在MM患者中表達升高，且與MM患者的不良預后密切相關；在細胞和動物模型中，HPSE表達上調可以促進骨髓瘤細胞生長、轉移以及腫瘤新生血管生成，但其中涉及的具體機制尚未完全闡明[3]。Runt相關的轉錄因子2(runt related transcription factor 2，Runx2)是Runt相關的基因家族成員，其作為骨和軟骨形成相關的轉錄因子，被認為是骨形成的主要調控者之一[4]。近年來，Runx2被發(fā)現(xiàn)在包括MM在內的多種腫瘤中表達增高，且腫瘤中異常的Runx2表達與腫瘤骨轉移、疾病進展以及不良預后密切相關[5]。在腫瘤細胞中，Runx2作為重要的轉錄因子可以被多種因素調節(jié)，也可以通過調控下游多種信號因子的表達影響細胞功能。關于HPSE與Runx2的關系，目前研究較少。本研究試圖通過檢測在不同HPSE表達水平的骨髓瘤細胞中Runx2的含量以及Runx2對下游基因RANKL、MMP9調控等方式，以探討在骨髓瘤細胞中HPSE與Runx2之間的關系。

材料與方法

1.試劑與材料：Runx2抗體(英國Abcam公司)，Lamin A/C抗體、β-actin抗體(美國Cell Signaling公司)，重組人HPSE(recombinant human heparanase，rhHPSE)藥物(美國R&D公司)，HPSE抑制劑PD98059藥物(美國Sigma-Aldrich公司)；人CAG骨髓瘤細胞系來自美國阿拉巴馬大學伯明翰分校病理系Dr.Yang Yang實驗室；CAG細胞通過轉染包含HPSE cDNA的質粒載體構建HPSE過表達細胞即HPSE-high細胞，通過轉染空質粒載體構建對照細胞即HPSE-low細胞；CAG細胞通過轉染包含HPSE shRNA的慢病毒載體構建HPSE沉默表達細胞即HPSE k/d細胞，通過轉染包含non-target shRNA的慢病毒載體構建對照細胞即shRNA control細胞。

2.目標基因質粒構建及轉染：將人HPSE cDNA亞克隆入pIRES2-EGFP真核表達載體 (Clontech，日本TaKaRa公司)中，構建出重組質粒。將重組質粒以及空載體與Lipofectin和Opti-MEM I轉染試劑(Invitrogen，美國Thermo Fisher公司)混合后轉染人CAG骨髓瘤細胞，細胞轉染后予G418進行抗藥性篩選及進行流式細胞儀GFP陽性細胞分選，得到穩(wěn)定轉染的HPSE過表達細胞以及對照細胞。

3.目標基因沉默表達：分別將包含HPSE shRNA以及non-target shRNA的慢病毒顆粒(美國Sigma-Aldrich公司)與人CAG骨髓瘤細胞共培養(yǎng)，48h后加入嘌呤酶素溶液進行耐藥細胞篩選，藥物濃度依據嘌呤酶素殺傷曲線所得，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，待細胞獲得重建并生長至較佳狀態(tài)時，收取細胞，提取蛋白進行Western blot法檢測，評估預定基因沉默表達情況，以篩選出效果最佳的HPSE k/d細胞以及對照細胞。HPSE shRNA序列：5′-CCGGCCATAATGTCACCAAG-TACTTCTCGAGAAGTACTTGGTGACATTATGGTTTTT-TG-3′，non-target shRNA序列：5′-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTC-ATCTTG-TTGTTTTT-3′。

4.細胞培養(yǎng)：人CAG骨髓瘤細胞用RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清(美國Thermo Fisher公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、1% L-谷氨酰胺，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、飽和濕度、5%CO2，培養(yǎng)液每2天更換1次，實驗所用的細胞進入對數生長期后按照1∶3～1∶4的比例傳代。

5.Western blot法：采用80μl RIPA細胞裂解液裂解細胞，旋渦振蕩后再加入20μl 5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100℃加熱40min。取等量總蛋白進行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜70V恒壓濕法轉膜1h后，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，先后與一抗和二抗孵育，最后ECL顯色。Western blot法條帶采用Image J軟件進行定量分析。

6.染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)：經預處理的細胞用終濃度為1%的甲醛溶液固定10min，使轉錄因子與DNA交聯(lián)，用細胞裂解液破膜后，通過超聲將DNA打碎成250～1000bp片段。用Runx2特異性抗體沉淀DNA-蛋白復合物，用蛋白A+G瓊脂糖吸附復合物，經洗去非特異性吸附后，解交聯(lián)，沉淀的DNA片段于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7.qPCR擴增ChIP后DNA產物：針對RANKL啟動子、MMP9啟動子區(qū)域的DNA序列設計引物，RANKL啟動子引物：(F)5′-CAGAAGATGGCACTCACTGCA-3′，(R)5′-CACCATCGCTTTCTCTGCTCT-3′;MMP9啟動子引物：(F)5′-TGACAGCGACAAGAAGTG-3′，(R)5′-CAGTGAAGCGGTACATAGG-3′。擴增條件：94℃ 5min 預變性，94℃ 變性30s，退火溫度 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)后，每個循環(huán)結束后進行熒光信號收集。每個反應設3個復孔，以2-ΔΔct計算DNA相對表達水平。

結 果

1.不同HPSE表達水平的骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2的表達含量：為了研究在骨髓瘤細胞中HPSE與轉錄因子Runx2的相關性，筆者檢測不同HPSE表達水平的骨髓瘤細胞中Runx2的表達含量。首先，通過轉染質粒的方法構建HPSE過表達骨髓瘤細胞HPSE-high和對照細胞HPSE-low，通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)與對照細胞比較，HPSE-high骨髓瘤細胞中Runx2表達升高；通過轉染包含shRNA慢病毒顆粒的方法構建HPSE沉默表達骨髓瘤細胞HPSE k/d和對照細胞shRNA control，通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)與對照細胞比較，HPSE k/d骨髓瘤細胞中Runx2表達減少；其次，在培養(yǎng)HPSE低表達的骨髓瘤細胞HPSE-low時加入不同濃度外源性的rhHPSE，培養(yǎng)48h后，通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，HPSE-low骨髓瘤細胞中Runx2的表達逐漸升高；再次，在培養(yǎng)HPSE過表達的骨髓瘤細胞HPSE-high時加入HPSE抑制劑PD98059，培養(yǎng)48h后，通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)與對照組比較，加入HPSE抑制劑可抑制HPSE-high骨髓瘤細胞中Runx2的表達(圖1)。

圖1 不同HPSE表達水平的骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2的表達含量A.不同HPSE表達水平的骨髓瘤細胞中Runx2的表達；B.在HPSE-low骨髓瘤細胞培養(yǎng)過程中加入不同濃度的rhHPSE，Western blot法檢測Runx2的表達；C.在HPSE-high骨髓瘤細胞培養(yǎng)過程中加入HPSE抑制劑PD98059，Western blot法檢測Runx2的表達

2.不同HPSE表達水平的骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2結合RANKL、MMP9啟動子區(qū)域的DNA含量：為了研究在HPSE高表達骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2對下游基因的調控作用是否增強，采用染色質免疫共沉淀的方法，在HPSE高表達骨髓瘤細胞HPSE-high與對照細胞HPSE-low中，使用Runx2特異性抗體沉淀DNA-蛋白復合物，采用qPCR的方法分別檢測轉錄因子Runx2所結合的與骨髓瘤細胞侵襲功能相關的重要分子RANKL、MMP9啟動子區(qū)域DNA表達含量，發(fā)現(xiàn)與對照細胞比較，HPSE-high骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2結合的RANKL、MMP9啟動子區(qū)域DNA含量顯著升高(圖2)。

圖2 不同HPSE表達水平骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2結合RANKL和MMP9啟動子區(qū)域的DNA含量與HPSE low組比較，*P<0.05

討 論

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種來源于漿細胞的惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)腫瘤的10%。MM以惡性的漿細胞增生、血清和尿中存在單克隆免疫球蛋白為特征，其可以導致貧血、腎功能不全、廣泛的骨損害、高鈣血癥以及嚴重的感染等一系列不良事件[1]。盡管在過去的20年間針對MM的治療已取得很大進展，但MM仍舊不可治愈[6]。因此，有待識別更多的分子靶點以用于新藥的研發(fā)。

乙酰肝素酶(HPSE)是一種內源性β-D-葡萄糖醛酸酶，其在MM患者中高表達，且與不良預后密切相關[3,7]。HPSE的上調促進骨髓瘤細胞生長、骨轉移和新生血管生成，但其中所涉及相關機制尚待進一步研究[8,9]。筆者研究顯示骨髓瘤源性的HPSE可作用于骨髓微環(huán)境，誘導骨髓瘤細胞展現(xiàn)間質樣特征，增加其播散至遠處的能力，促進骨髓瘤骨轉移的發(fā)生[10]。Runx2是Runt相關的基因家族成員，其作為骨和軟骨形成相關的轉錄因子，被認為是骨形成的主要調控者之一[4]。近年來Runx2被發(fā)現(xiàn)在包括MM在內的多種腫瘤中表達增高，且腫瘤中異常的Runx2表達與腫瘤骨轉移、疾病進展以及不良預后密切相關[11]。Trotter等[12]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細胞中Runx2表達增高可以促進骨轉移的發(fā)生，其可以作為骨髓瘤骨病的一個主要調控因子。關于HPSE與Runx2的關系，目前尚無文獻報道HPSE可以直接促進Runx2的活化，但HPSE切割后的硫酸乙酰肝素蛋白多糖鏈可以協(xié)同F(xiàn)GF2信號調控Runx2的表達和活化[13]。筆者研究發(fā)現(xiàn)在骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2的表達含量同步于HPSE表達水平，提示HPSE可能通過直接或間接的方式促進轉錄因子Runx2的表達和活化。

研究顯示，在骨髓瘤細胞中HPSE促進腫瘤細胞發(fā)生骨轉移和新生血管生成通過調控相關蛋白的表達實現(xiàn)。其中，RANKL屬于腫瘤壞死因子超家族的成員，主要由骨髓基質細胞、成骨細胞和活化的T淋巴細胞產生。在正常情況下，巨噬細胞集落刺激因子可以刺激前體破骨細胞數目增加，RANKL通過與前體破骨細胞上RANK受體相結合，刺激其分化為成熟破骨細胞并且減少破骨細胞凋亡，進而增加破骨活性[14]。在MM中，骨髓瘤細胞在與骨髓微環(huán)境作用下可刺激骨髓基質細胞和成骨細胞產生更多的RANKL，增加骨質破壞。Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細胞中HPSE的表達可以刺激RANKL表達和分泌，引起局灶性和系統(tǒng)性的溶骨性骨破壞。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類鋅依賴的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)重塑內肽酶，具有降解ECM成分的功能。ECM的降解與腫瘤細胞轉移和血管生成密切相關，因此，MMPs被認為是腫瘤生長和血管生成強有力的啟動子。在MM中，MMP9的表達增高，且與疾病復發(fā)和短的生存期密切相關。Purushothaman等[16]研究顯示，骨髓瘤細胞中HPSE的表達升高促進MMP9的表達和分泌增多，從而增加腫瘤細胞的侵襲性表型。Runx2作為轉錄因子可以激活包括RANKL、MMP9等多種下游的靶基因，導致腫瘤細胞的多種行為發(fā)生改變[17，18]。筆者研究發(fā)現(xiàn)HPSE高表達的骨髓瘤細胞中轉錄因子Runx2結合RANKL、MMP9啟動子區(qū)域的DNA含量增高，提示HPSE高表達的骨髓瘤細胞可以通過轉錄因子Runx2調控使RANKL、MMP9的表達增加，進而增強骨髓瘤細胞的骨轉移和侵襲性特征。因此，筆者提出HPSE可通過轉錄因子Runx2調控骨髓瘤細胞的功能。

綜上所述，本研究驗證了在骨髓瘤細胞中HPSE表達增高可以促進轉錄因子Runx2的表達，同時可以通過增加Runx2與調控RANKL、MMP9啟動子區(qū)域DNA相結合的方式達到調控骨髓瘤細胞功能的目的。該研究探討了HPSE可以促進MM疾病進展中的相關機制，HPSE及Runx2有望成為治療MM的分子靶點。今后將在臨床樣本中驗證HPSE與Runx2的相關性，以及探尋在骨髓瘤細胞中HPSE促進Runx2表達和活化的相關機制。