SD大鼠顱骨垂直引導(dǎo)骨再生模型的建立

張澤鵬 盧旭光

人工種植牙技術(shù)現(xiàn)已成為缺牙修復(fù)的首選治療方案。種植手術(shù)的成功依賴于足夠的牙槽骨能為種植體提供良好的初期穩(wěn)定性，以確保種植體與牙槽骨能形成穩(wěn)定的骨結(jié)合[1]。然而，拔牙后的骨改建、外傷、牙周炎、頜面部腫瘤等因素常會(huì)引起患者牙槽骨的吸收和缺損，導(dǎo)致牙槽骨寬度與高度的不足[2]。其中常用的骨增量技術(shù)如引導(dǎo)骨再生(guide bone regeneration，GBR)、骨劈開(kāi)、游離塊狀骨移植術(shù)可有效恢復(fù)牙槽嵴寬度。但恢復(fù)牙槽骨高度是目前未能有效解決的問(wèn)題[3～5]。一個(gè)合適的用于研究垂直骨增量植骨材料的動(dòng)物模型對(duì)研究者評(píng)估新材料的生物相容性、成骨性非常必要。本研究成功構(gòu)建了大鼠顱骨垂直引導(dǎo)骨再生模型，現(xiàn)介紹如下。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，2月齡，體質(zhì)量320g。動(dòng)物來(lái)源于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(晉)2019-0005。該實(shí)驗(yàn)由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(SYDL2020007)。

2.實(shí)驗(yàn)材料：主要器械及藥物包括定制鈦殼(直徑10mm，高6mm的類圓柱體，頂部有圓孔，太原鋼鐵集團(tuán)有限公司，圖1A)，膨體型聚四氟乙烯(expanded-polytetrafluoroethylene，e-PTFE)膜[直徑12mm圓形，內(nèi)面與鈦殼頂部肩臺(tái)對(duì)應(yīng)部位設(shè)計(jì)有醫(yī)用雙面膠(型號(hào)3M1522)](深圳四維拓達(dá)科技有限公司),脫蛋白牛骨基質(zhì)(deproteinized bovine bone matrix，DBBM，正海生物公司)。主要器械包括牙科打磨機(jī)，慢速?gòu)潤(rùn)C(jī)頭(深圳市益岳牙科器材有限公司)，9mm、10mm 環(huán)形取骨鉆(英國(guó)百諾公司)。主要藥品包括戊巴比妥納(西安科昊生物有限公司)，阿替卡因腎上腺素注射液(produits dentaires pierre rolland)，青霉素(北京索萊寶有限公司)等。

3.模型建立的手術(shù)過(guò)程：將大鼠隨機(jī)分為兩組，即支架組和空白組(每組12只)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前對(duì)手術(shù)器械，鈦殼等清洗后進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌處理。大鼠禁食6h后，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉大鼠。大鼠頭部剃毛，消毒，使用無(wú)菌記號(hào)筆在術(shù)區(qū)設(shè)計(jì)U型瓣。阿替卡因進(jìn)行皮下注射，局部鎮(zhèn)痛。使用顯微眼科剪沿著標(biāo)記做U型瓣，翻開(kāi)的皮瓣用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液潤(rùn)濕的紗布包裹置于大鼠頸部。骨膜剝離器去除大鼠顱骨中央偏頸部的部分骨膜。在無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液的沖洗下，使用10mm環(huán)形取骨鉆在大鼠顱骨做一環(huán)形骨裂隙，深度0.5mm。在無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液的沖洗下，使用裂鉆在骨裂隙內(nèi)部做數(shù)個(gè)皮質(zhì)骨穿孔，深度控制在剛好可以誘導(dǎo)出血，但不傷及大鼠硬腦膜。將鈦殼放置在環(huán)形骨裂隙中，通過(guò)中央小孔填充DBBM(支架組)。e-PTFE膜封閉中央小孔，縫合?？p合后大鼠局部涂抹紅霉素軟膏進(jìn)行局部抗菌處理。術(shù)后連續(xù)3天大鼠腹腔注射青霉素(80000U/d)預(yù)防感染。手術(shù)過(guò)程詳見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠顱骨垂直引導(dǎo)骨再生模型的構(gòu)建過(guò)程A.鈦殼外形；B.剃毛，消毒,紅線代表耳緣和眼眶緣內(nèi)側(cè)，與皮瓣位置距離1cm左右；C.翻瓣，去除骨膜，制備環(huán)形骨裂隙；D.環(huán)形骨裂隙位置,黑線為兩耳前緣連線；E.皮質(zhì)骨穿孔；F.放置鈦殼，填充植骨材料；G.e-PTFE膜封閉小孔；H.縫合

4.術(shù)后觀察：手術(shù)后嚴(yán)密觀察大鼠傷口愈合情況。術(shù)后3、7、14天對(duì)大鼠顱骨鈦殼部位輕輕觸診，并記錄鈦殼松動(dòng)情況。持續(xù)對(duì)大鼠軟組織進(jìn)行觀察，并記錄情況。術(shù)后12周，腹腔注射過(guò)量戊巴比妥納安樂(lè)死大鼠，取材。無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗后，標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48h。取出樣本，PBS沖洗3次，樣本放入75%乙醇溶液中4℃ 保存送檢。

5.Micro-CT掃描：將樣本置于SkyScan 1176(德國(guó)布魯克公司)的掃描球管中，固定，掃描。掃描參數(shù)如下，電壓65kV，電流385μA，曝光時(shí)間340ms，掃描分辨率12.59μm，步長(zhǎng)0.800°。掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，選取樣本中央直徑5mm、高度6mm的圓柱體為要分析的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)。對(duì)空白組和支架組ROI內(nèi)的骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BVF)進(jìn)行分析。這里的骨體積分?jǐn)?shù)定義為新骨體積/感興趣區(qū)總體積×100 (%)。

6.組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)分析：完成micro-CT掃描的樣本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，塑化液塑化，包埋，硬組織切片，厚度10μm。組織切片進(jìn)行HE染色，染色后進(jìn)行白光掃描，將圖形數(shù)據(jù)導(dǎo)入個(gè)人電腦，使用CaseViewer軟件觀察骨組織情況及拍照，Image-ProPlus 6.0軟件對(duì)樣本垂直骨高度(vertical bone height，VBH)進(jìn)行測(cè)量。

結(jié) 果

1.大體觀察結(jié)果：術(shù)后大鼠1h內(nèi)相繼蘇醒，并飲食正常(圖2A)。術(shù)后對(duì)大鼠軟組織情況進(jìn)行觀察并記錄，空白組(1只)和支架組(2只)共3只大鼠在術(shù)后3～8天內(nèi)局部軟組織出現(xiàn)壞死，表現(xiàn)為結(jié)痂組織過(guò)多，皮膚緊縮嚴(yán)重，鈦殼暴露脫落。鈦殼脫落大鼠隨即排除。其余大鼠軟組織愈合情況良好，僅少量愈合性結(jié)痂組織(圖2B)，術(shù)后兩周左右軟組織完全恢復(fù)并進(jìn)行了明顯的適應(yīng)性改建(圖2C)。術(shù)后3、7、14天對(duì)大鼠顱骨鈦殼部位輕輕觸診，評(píng)估鈦殼固位情況。除去軟組織壞死導(dǎo)致的鈦殼脫落，其余大鼠鈦殼均固定在設(shè)計(jì)位置。12周后取材，可見(jiàn)e-PTFE膜未脫落(圖3A)，周圍皮膚未出現(xiàn)紅腫等炎性反應(yīng)，鈦殼位于手術(shù)設(shè)計(jì)區(qū)域(圖3A)?？瞻捉M骨組織與鈦殼輕輕使用外力即可以分離，而支架組骨組織與鈦殼難以分離(圖3B)，需借助9mm環(huán)形取骨鉆將樣本與鈦殼分離(圖3C)。

圖2 SD大鼠手術(shù)后軟組織愈合情況A.術(shù)后1h;B.術(shù)后7天拆線;C.術(shù)后14天

圖3 骨組織樣本情況A.鈦殼穩(wěn)定在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)區(qū)域；B.骨組織包裹鈦殼；C.骨組織樣本與鈦殼分離整體觀

2.Micro-CT分析：支架組micro-CT矢狀剖面圖4可見(jiàn)，鈦殼固定在手術(shù)設(shè)計(jì)部位，未發(fā)生移位，且鈦殼內(nèi)面與新骨組織結(jié)合緊密。支架組的BVF為41.05%±5.04%，顯著大于空白組22.75%±5.77%(P=0.000)。

圖4 Micro-CT掃面樣本示意圖A.空白組三維重建圖；B.支架組矢狀剖面圖；C.ROI示意圖，中央灰色部分為ROI

3.組織學(xué)觀察：組織切片觀察，空白組在此模型下有一定的成骨潛力。顱骨表面形成含有骨髓腔的松質(zhì)骨(圖5A)?？瞻捉M垂直骨增量最高處位于樣本中央。新骨頂部覆蓋有結(jié)締組織，內(nèi)有大量毛細(xì)血管(圖5B)。支架組樣本可見(jiàn)由骨組織，DBBM顆粒以及結(jié)締組織構(gòu)成(圖5D)。新骨主要沉積在靠近基底骨附近，并與顱骨融合，難以與顱骨區(qū)分(圖5 C)。中部可觀察到結(jié)締組織包圍著DBBM顆粒，與DBBM顆粒接觸的界面有大量單核細(xì)胞，新骨組織無(wú)炎性反應(yīng)。

圖5 HE染色圖A.空白組代表性切片(×15)；B.A圖片中黑色方框區(qū)域(×1500)；C. 支架組代表性切片(×10)；D.C圖黑色方框區(qū)域(×1000)；NB.新骨;CT.結(jié)締組織;DBBM.脫蛋白牛骨基質(zhì);黑色圓圈所示為毛細(xì)血管

4.組織形態(tài)學(xué)分析：支架組的VBH(2.27±0.31mm)略優(yōu)于空白組(1.86±0.20mm，P=0.002,圖6)。

圖6 Micro-CT分析結(jié)果和組織形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果A.Micro-CT分析結(jié)果；B.組織形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果；空白組n=11；支架組n=10;*P<0.05

討 論

GBR即在骨缺損區(qū)使用屏障膜隔離上皮組織和結(jié)締組織，使成骨細(xì)胞在沒(méi)有其他細(xì)胞干預(yù)的情況下遷徙到骨缺損區(qū)并產(chǎn)生新骨[6]。本實(shí)驗(yàn)基于GBR的原理構(gòu)建大鼠顱骨垂直引導(dǎo)骨再生模型，通過(guò)使用具有隔絕周圍軟組織以及支撐顆粒材料的屏障外殼來(lái)模擬臨床上使用的屏障膜，可以為骨移植材料提供良好的成骨環(huán)境。從胚胎起源的角度來(lái)講，顱骨與頜骨具有相同的胚胎起源[7]。從愈合模式來(lái)講，顱骨與頜骨都是膜內(nèi)成骨[8]；從臨床轉(zhuǎn)化的角度來(lái)講，扁平的顱骨與重度萎縮的頜骨相似，因此可以選擇顱骨作為研究用于垂直骨增量植骨材料的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)選用320g雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象出于以下考慮：①對(duì)新材料或者新技術(shù)的初步探索，大鼠具有其他動(dòng)物不可比擬的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)；②320g SD大鼠的顱骨較為平坦，可以選取較大范圍的植骨區(qū)域進(jìn)行屏障殼的安放；③SD大鼠相比于其他品系，性格較為溫順，方便手術(shù)操作以及術(shù)后護(hù)理。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的屏障殼裝置為直徑10mm、高6mm、頂部開(kāi)孔的類圓柱形鈦殼。通過(guò)將鈦殼放置在制備的環(huán)形骨裂隙上來(lái)防止其平行移動(dòng)，通過(guò)頭部皮膚的張力進(jìn)一步固定鈦殼。對(duì)術(shù)后大鼠觀察表明，在軟組織良好愈合的情況下，鈦殼不會(huì)發(fā)生移位。鈦殼頂部小孔用帶有醫(yī)用雙面膠的e-PTFE膜封閉。e-PTFE膜具有生物惰性，其表面小孔具有限制上皮細(xì)胞遷移的功能，臨床上常使用金屬加強(qiáng)型e-PTFE膜處理復(fù)雜的垂直骨增量手術(shù)[10,11]。對(duì)內(nèi)部皮膚和骨組織切片的觀察證實(shí)醫(yī)用雙面膠與鈦殼肩臺(tái)相接觸，不會(huì)引起大鼠局部炎性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)鈦殼設(shè)計(jì)與Zigdon等[12]的外殼設(shè)計(jì)比較，簡(jiǎn)化了屏障裝置的加工與制作，同時(shí)手術(shù)操作更為便捷，不需要額外的螺釘固位屏障裝置，同時(shí)頂部開(kāi)孔設(shè)計(jì)方便了植骨材料的填充。類圓柱體設(shè)計(jì)與半球形屏障裝置比較，植骨材料能填充到均勻的高度，在后期容易比較成骨效果[13]。鈦殼與機(jī)體組織具有良好的生物相容性，支架組Micro-CT矢狀剖面圖可觀察到新骨沿著鈦殼壁生長(zhǎng)，保證了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鈦殼的穩(wěn)定性。Lai等[14]設(shè)計(jì)了一種帶螺紋的自攻型鈦筒，并成功構(gòu)建兔顱骨垂直骨增量模型。但大鼠顱骨較薄，此鈦筒設(shè)計(jì)不適用于大鼠顱骨模型的構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)在大鼠顱骨僅放置一個(gè)鈦殼，這是由于大鼠顱骨面積所限。對(duì)空白組樣本的觀察表明大鼠顱骨在此模型中有一定的自發(fā)垂直向成骨潛能，Zigdon等[12]開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)(空白組新骨高度可達(dá)1.52±0.18mm)。有實(shí)驗(yàn)小組通過(guò)降低屏障裝置高度與直徑，每只大鼠接受兩個(gè)屏障裝置[15]。雖然能減少大鼠的使用數(shù)量，但過(guò)小尺寸的屏障裝置可能會(huì)被大鼠自身的成骨潛能所影響，不能客觀地比較不同生物材料的垂直成骨潛力。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠顱骨垂直引導(dǎo)骨再生模型，可操作性強(qiáng)，能客觀比較不同植骨材料的垂直骨成骨潛力，為研究垂直骨增量植骨材料的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。