低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜的作用

斯彩娟 章小艷 王衛(wèi)光 周 鋒 張 倫

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性、非特異性腸道炎癥，西方發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)生率較高[1]。近年來(lái)，我國(guó)UC發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)UC發(fā)生率約為11.6/10萬(wàn)[3]。UC病程遷延易復(fù)發(fā)，極易發(fā)生癌變，已成為引起結(jié)腸癌的主要原因之一，給社會(huì)及患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4,5]。UC病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但飲食因素在其發(fā)生、發(fā)展及治療過(guò)程中具有重要作用。近年來(lái)低FODMAP飲食在UC轉(zhuǎn)歸中的作用逐漸受到關(guān)注。但尚缺乏相關(guān)研究證據(jù)，本研究旨在探討低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)UC大鼠腸道黏膜炎性因子及通透性的作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性Wistar大鼠40只購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)，體質(zhì)量210±10g，溫度22±2℃，自由攝取食物及飲水。

2.主要試劑:白介素-8(interleukin-8,IL-8)抗體、白介素-33 (interleukin-33, IL-33)抗體、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、閉合蛋白(occludin)抗體，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；蘇木精、伊紅購(gòu)自德國(guó)BASO公司。

3.造模：從40只雄性大鼠中隨機(jī)選取10只作為A組，其余30只利用TNBS灌腸法(5%TNBS與35%乙醇1∶1配成灌腸液)制作UC模型。造模前禁食36h，用灌胃針輕輕從肛門(mén)插入，推入灌腸液(100mg/kg TNBS)，提尾倒立1min后放回籠中自然蘇醒，并常規(guī)飼養(yǎng)，建模第3天判斷造模是否成功，并開(kāi)始給予相應(yīng)干預(yù)措施。

4.干預(yù)及標(biāo)本采集:造模成功后將UC大鼠隨機(jī)分為3組，即B、C、D組，并給予相應(yīng)干預(yù)措施。A組、B組、C組飼料同前，均為SPF級(jí)鼠糧，包括小麥、玉米、麩皮、豆柏和酵母粉等；D組給予制備的低FODMAP鼠糧，包括大米、南瓜、小米、燕麥、土豆、白菜和葡萄糖等[6]。C組、D組均予以美沙拉嗪灌胃，劑量為0.5g/(kg·d)。干預(yù)治療周期12天，末次給藥后24h處死，取出每只大鼠結(jié)腸黏膜組織，挑取潰瘍最明顯處腸段，若無(wú)潰瘍則選取紅腫糜爛較明顯處腸段，沿縱軸切開(kāi)，分為5份，進(jìn)行相應(yīng)處理，并保存待測(cè)。

5.DAI評(píng)價(jià):記錄并統(tǒng)計(jì)造模后第3、4、7、10、15天各組大鼠的DAI，參照Murano等所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3[7],詳見(jiàn)表1。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

6.病理組織學(xué)評(píng)分：制作大鼠結(jié)腸組織切片，光鏡下觀察病理改變并評(píng)分，在視野下隨機(jī)選8處評(píng)分并取均值，參照以下標(biāo)準(zhǔn)：正常腸黏膜計(jì)0分；少1/3隱窩計(jì)1分；少2/3隱窩計(jì)2分；固有層被單層上皮細(xì)胞覆蓋和較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)3分；炎性細(xì)胞數(shù)量增多并有炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)計(jì)4分[8]。

7.大體標(biāo)本評(píng)分：參照以下標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)損傷為0分；黏膜充血為1分；潰瘍面積<受損面積的25%為2分；潰瘍面積=受損面積的25%～50%為3分；潰瘍面積>受損面積的50%為4分。

8.腸道黏膜炎性因子水平及通透性測(cè)定：提取大鼠結(jié)腸組織蛋白，-80℃保存待測(cè)。利用ELISA測(cè)定腸黏膜組織中IL-8、IL-33、TNF-α水平，采用Western blot法檢測(cè)E-cadherin、ZO-1、occludin的表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.動(dòng)物模型評(píng)價(jià)：建模前大鼠反應(yīng)靈活，毛色光潤(rùn)，活動(dòng)、飲食及大小便均正常，建模后相繼出現(xiàn)稀爛便、黏液便、血便，伴倦怠懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)凌亂、拱背、飲食飲水減少、體重下降等現(xiàn)象。隨機(jī)選取2只大鼠，處死后取出結(jié)腸組織(肛門(mén)上段2～10cm)可見(jiàn)結(jié)腸明顯水腫、充血、潰瘍，病理切片提示結(jié)腸炎。

2.DAI結(jié)果比較：建模成功后(建模第3天)，除A組外，其余各組大鼠DAI均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B、C、D組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)治療后，A組和B組大鼠DAI均未發(fā)生明顯變化，治療組大鼠DAI均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且D組下降趨勢(shì)更明顯。其中，造模第4天，治療組大鼠DAI略低于模型組大鼠，3組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模第7、10、13、15天，治療組大鼠DAI均顯著低于B組，且D組均顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 大鼠DAI評(píng)分

3.HS和GS結(jié)果比較：B組大鼠結(jié)腸黏膜HS和GS較A組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后，治療組大鼠結(jié)腸黏膜HS和GS較模型組均顯著下降，且D組顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 大鼠病理組織學(xué)評(píng)分和大體標(biāo)本評(píng)分

4.大鼠腸黏膜的組織病理學(xué)特征：A組大鼠的結(jié)腸切片完整，腺體分泌大量黏蛋白。B組大鼠結(jié)腸顯示出黏膜嚴(yán)重壞死，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及黏膜下層水腫；經(jīng)治療后，C組大鼠腸黏膜糜爛顯著減少，黏膜下層輕微水腫，幾乎無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D組大鼠腸黏膜未顯示出明顯的病理學(xué)改變(圖2)。

圖2 大鼠結(jié)腸黏膜病理切片(HE，×200)A.健康對(duì)照組;B.模型組;C.普通飲食+美沙拉嗪組;D.低FODMAP飲食+美沙拉嗪組

5.炎性因子表達(dá)水平比較：B組大鼠IL-8、IL-33和TNF-α表達(dá)水平較A組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后，治療組大鼠IL-8、IL-33和TNF-α表達(dá)水平較B組顯著降低，且D組顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 大鼠結(jié)腸黏膜炎性因子水平

6.大鼠腸道黏膜通透性比較：B組大鼠腸黏膜E-cadherin、ZO-1和occludin的表達(dá)水平較A組顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后，治療組大鼠腸黏膜中E-cadherin、ZO-1和occludin的表達(dá)水平較B組顯著上調(diào)，且D組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 大鼠腸道黏膜通透性相關(guān)蛋白表達(dá)情況與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05

討 論

近年來(lái)，飲食干預(yù)治療UC逐漸受到重視，尤其是低FODMAP飲食，已有研究證實(shí)低FODMAP飲食可以顯著改善腸易激綜合征患者臨床癥狀和體征，但低FODMAP飲食對(duì)UC的作用尚不清楚[9]。本研究結(jié)果表明低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪治療UC可以有效促進(jìn)腸道黏膜恢復(fù)，緩解其癥狀。這與相關(guān)人群研究結(jié)果一致，有研究顯示，利用低FODMAP飲食對(duì)胃腸道功能紊亂患者進(jìn)行干預(yù)，可有效降低UC活動(dòng)度，緩解其臨床癥狀[10～12]。

目前，普遍認(rèn)為UC與免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和腸道黏膜通透性增加相關(guān)。TNF-α是一類普遍存在的炎性細(xì)胞因子，作為UC發(fā)病過(guò)程中重要的啟動(dòng)因子，在UC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，不僅可以引起局部組織的炎性反應(yīng)，而且可以刺激機(jī)體相關(guān)細(xì)胞釋放多種促炎因子，其中，IL-8可通過(guò)趨化作用，并與TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜組織細(xì)胞浸潤(rùn)增加，加重腸黏膜炎性損傷，大量研究顯示，TNF-α的表達(dá)水平與UC的嚴(yán)重程度具有明顯的線性關(guān)系[13,14]。IL-33可以通過(guò)作用于IL-33/ST2信號(hào)通路刺激機(jī)體產(chǎn)生多種炎性因子，促進(jìn)腸道黏膜產(chǎn)生炎性反應(yīng)，加重其損傷[15]。有研究表明，機(jī)體IL-33的表達(dá)水平與UC活動(dòng)度呈正相關(guān)，可作為UC發(fā)病的預(yù)測(cè)因子[16]。而腸道黏膜通透性增加，可導(dǎo)致腸道菌群移位，破壞腸道穩(wěn)態(tài)，引起炎性反應(yīng)。同時(shí)，炎性反應(yīng)又導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，形成惡性循環(huán)[17]。FODMAP飲食是一類可發(fā)酵的短鏈碳水化合物，包括可發(fā)酵的低聚糖、雙糖、單糖和多元醇，該類食物攝入過(guò)多不僅可以增加腸道黏膜通透性，導(dǎo)致腸腔內(nèi)液體量增加和小腸體積擴(kuò)張，引起腸道菌群移位，進(jìn)而誘發(fā)或加重相關(guān)炎性反應(yīng)；而且過(guò)多的低聚糖及乳糖，經(jīng)腸道微生物發(fā)酵可產(chǎn)生大量氣體及正丁酸，引起腸腔擴(kuò)張和內(nèi)臟高敏感，導(dǎo)致炎性反應(yīng)[18]。本研究建模后，B組大鼠腸道黏膜IL-8、IL-33和TNF-α表達(dá)水平較A組顯著上升，腸道黏膜通透性增加；經(jīng)治療后，D組大鼠腸道黏膜中IL-8、IL-33和TNF-α表達(dá)水平顯著降低，腸道黏膜通透性得到改善，且效果優(yōu)于C組。表明低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪可以顯著降低UC大鼠結(jié)腸黏膜相關(guān)炎性因子的表達(dá)，改善腸道黏膜通透性。

綜上所述，低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪治療UC大鼠可以提高其臨床療效，不僅可以改善其癥狀，促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)，而且可以顯著降低炎性因子表達(dá)水平，改善腸黏膜通透性，緩解其炎癥。其機(jī)制可能是：①低FODMAP飲食可通過(guò)促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞VD受體及細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)，降低腸道黏膜通透性，減少菌群移位，減輕炎性反應(yīng)[19]；②低FODMAP飲食可通過(guò)減少組胺及結(jié)腸內(nèi)氣體、液體的產(chǎn)生，降低內(nèi)臟高敏感度，緩解相關(guān)癥狀[20～22]；③低FODMAP飲食可以通過(guò)抑制NF-κB炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、增加T細(xì)胞生成而發(fā)揮其抗炎作用[23]。但目前關(guān)于其機(jī)制尚不明確，仍需要開(kāi)展進(jìn)一步研究予以證實(shí)。