應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片對(duì)妊娠期單基因致病型高血壓的研究

孫成娟 劉曉巍

妊娠期高血壓是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要原因，妊娠期常用的降壓藥物為腎上腺受體阻滯劑(拉貝洛爾)、鈣離子拮抗劑(硝苯地平、尼卡地平)和α受體阻滯劑(酚妥拉明)等[1]。若血壓仍無(wú)法控制，短期內(nèi)迅速升高，發(fā)生高血壓急癥，必要時(shí)短期應(yīng)用硝普鈉降壓后醫(yī)源性終止妊娠，尤其是孕周<28周者，且這類(lèi)胎兒存活率極低。單基因致病型高血壓是由單個(gè)基因突變直接引發(fā)的高血壓，常表現(xiàn)為難治性高血壓，服用3～4種降壓藥物而血壓仍不能達(dá)標(biāo)，并且靶器官損害嚴(yán)重，起病時(shí)間早，程度重，同時(shí)伴有較多并發(fā)癥。單基因致病型高血壓致病基因目前有17種，包括40余種亞型[2，3]。國(guó)際上研究單基因致病型高血壓多為男性患者或高血壓門(mén)診住院患者，而妊娠期進(jìn)行單基因致病型高血壓的發(fā)病情況的研究，目前國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道[4,5]。隨著妊娠的進(jìn)展，心血管系統(tǒng)容量增加，增加了對(duì)孕婦合并癥的考驗(yàn)。而單基因致病型高血壓患者妊娠時(shí)，應(yīng)用妊娠期常用的降壓藥物治療無(wú)效。高血壓急癥可發(fā)生于有或沒(méi)有既往存在慢性高血壓病史的患者[6]。國(guó)外對(duì)絕大多數(shù)單基因致病性高血壓患者均進(jìn)行了致病基因的突變檢測(cè)，而國(guó)內(nèi)在這方面的工作亦初步開(kāi)展。考慮到疾病的多樣性和致病基因突變的多樣性，本研究對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例進(jìn)行臨床表型的觀察和相關(guān)基因的突變檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)新的突變，加深對(duì)單基因致病型高血壓的認(rèn)識(shí)，并為臨床診治妊娠期高血壓疾病提供思路，并期望對(duì)既往有妊娠期高血壓急癥而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局病史且有再孕要求患者明確病因，給予針對(duì)性藥物調(diào)整，改善妊娠預(yù)后。

資料與方法

1.研究對(duì)象:選取2015年8月～2017年6月在筆者醫(yī)院行產(chǎn)前檢查，有慢性高血壓病史且于妊娠32周內(nèi)因高血壓急癥終止妊娠的漢族孕婦31例為研究組，另選擇同期無(wú)高血壓家族史且無(wú)合并癥和并發(fā)癥的正常孕婦31例為對(duì)照組，均隨訪至分娩結(jié)束。高血壓急癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：血壓明顯升高[舒張壓達(dá)120～130mmHg，同時(shí)合并靶器官損害；或收縮壓≥220mmHg和(或)舒張壓≥140mmHg，無(wú)論有無(wú)癥狀][7]；或應(yīng)用鹽酸拉貝洛爾100mg，每8h口服1次，加用硝苯地平緩釋片口服及應(yīng)用拉貝洛爾靜脈泵入及尼卡地平等多種藥物靜脈泵入，仍無(wú)法控制血壓。排除多胎妊娠，排除因心力衰竭、腎功能不全、高血壓眼底改變終止妊娠者，排除應(yīng)用鹽酸拉貝洛爾配合硝苯地平緩釋片治療可控制血壓者。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.臨床和實(shí)驗(yàn)室資料獲得：通過(guò)查閱電子病歷或電話咨詢(xún)獲得，包括年齡、孕周、高血壓病程、身高、體重、基礎(chǔ)血壓、不同時(shí)期血鉀水平及分娩后的血壓。本實(shí)驗(yàn)在百世諾(北京)醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行。

3.標(biāo)本取材及檢測(cè)內(nèi)容：抽取研究組終止妊娠時(shí)和正常孕婦妊娠32周時(shí)肘靜脈血5ml，加入到含有0.5ml 10%乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，立即提取基因組DNA。

4.基因組DNA的提取：使用QIAamp?DNA試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，參照標(biāo)準(zhǔn)操作方法提取血液中DNA。所有受檢樣本提取的DNA經(jīng)過(guò)檢測(cè)，吸光度(A)260/280為1.75～1.85，濃度>30ng/μl，質(zhì)量符合第2代測(cè)序要求，可以進(jìn)行建庫(kù)實(shí)驗(yàn)。

5.目標(biāo)基因芯片測(cè)序：使用液體處理自動(dòng)化設(shè)備(美國(guó)Perkin Elmer公司)修改基于溶液的Agilent SureSelect目標(biāo)富集系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)制備文庫(kù)。將3μg基因組DNA隨機(jī)片段化至250bp的平均大小，片段末端修補(bǔ)，接頭連接，缺口修補(bǔ)純化，擴(kuò)增文庫(kù)。同時(shí)靶基因定位，第2次擴(kuò)增測(cè)序。31例制備好的樣本文庫(kù)和31例對(duì)照文庫(kù)均使用MiSeq Reagent Kits V2試劑盒(美國(guó)Illumina公司)參照標(biāo)準(zhǔn)方案上機(jī)，在MiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，對(duì)得到的測(cè)序結(jié)果完成質(zhì)量評(píng)估后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

6.單基因致病型高血壓不同外顯子復(fù)合芯片：基因包括NF1B、CLCNKB、BSND、SDHC、AGT、CYP17A1、MEN1、SDHD、KCNJ5、SCNN1A、SLC12A1、SCNN1G、HSD11B2、NF1、CUL3、NF2、PPARG、CASR、NR3C2、GDNF、NR3C1、CYP11B1、CLCNKA、SDHB、KCNJ10、REN、RET、SDHAF2、CCND1、KCNJ1、WNK1、MAX、SLC12A3、SCNN1B、ACE、WNK4、TMEM127、VHL、CACNA1D、AGTR1、SDHA、KLHL3、CYP21A2、KIF1B。

7.測(cè)序質(zhì)量評(píng)估：每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量值(Qphred值)是由公式Qphred=-10log10(e)轉(zhuǎn)化得到，其中Q30表示堿基正確識(shí)別率達(dá)到99.9%。本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量主要分布在Q30(≥90%)以上，這樣可以更好地保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。使用去冗余后的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行覆蓋度、深度等統(tǒng)計(jì)。當(dāng)一個(gè)位點(diǎn)的堿基覆蓋深度達(dá)到150～100倍以上，并且該位點(diǎn)的突變頻率>20%，則認(rèn)為該位點(diǎn)處檢測(cè)出的單核苷酸多態(tài)性比較可信。

8.受檢樣本測(cè)序比對(duì)分析：本研究采用的參考基因組是Human GRCh37/hg19。使用BWA軟件將測(cè)序片段比對(duì)回參考基因組序列上，并使用Picard軟件去除測(cè)序序列中的重復(fù)。應(yīng)用Picard軟件去除聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增導(dǎo)致的重復(fù)序列后，應(yīng)用CLC Genomics Workbench軟件進(jìn)行序列對(duì)比和尋找基因差異。變異基因的檢測(cè)和定位致病變異。排除常見(jiàn)的基因多態(tài)性：等義突變，等位基因頻率≥1%(基于GO Exome序列基因計(jì)劃http:∥evs.gs.washington.edu，1000Genomes計(jì)劃http:∥www.1000genomes.org)；在正常人中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)；使用PolyPhen軟件和SIFT軟件預(yù)測(cè)基因多態(tài)性變異，前者評(píng)分越接近于1，后者評(píng)分<0.1被認(rèn)為變異致病性越強(qiáng)。然后使用4個(gè)在線突變致病性預(yù)測(cè)分析軟件Polyphen-2、SIFT、Mutation Taster和FATHMM對(duì)12個(gè)變異進(jìn)行生物信息學(xué)層面的突變致病性分析，得到每個(gè)變異的致病性預(yù)測(cè)。

結(jié) 果

31例高血壓急癥患者每個(gè)DNA樣本的堿基測(cè)序深度在45～160倍的范圍內(nèi)，10倍以上測(cè)序覆蓋度占比98.731%±0.508%。

考慮到高血壓急癥約占所有高血壓患者的1%～2%，且高血壓患者在所有人群中約占1/7，因此高血壓急癥在所有人群中占比約為2‰。在進(jìn)行變異篩選時(shí)，結(jié)合考慮該疾病可能的多基因致病特點(diǎn)，本研究將等位基因頻率大于1‰的變異過(guò)濾掉，因而保留31例患者中所有等位基因頻率低于1‰的變異。然后進(jìn)一步僅保留錯(cuò)義突變、移碼突變、無(wú)義突變、內(nèi)含子剪接位點(diǎn)突變，最終在11例患者中發(fā)現(xiàn)12個(gè)不同的基因變異，涉及10個(gè)不同基因。這12個(gè)變異的類(lèi)型均為錯(cuò)義突變、雜合突變。通過(guò)查閱包括千人基因組和ExAC等外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究發(fā)現(xiàn)的12個(gè)變異中有7個(gè)變異的等位基因頻率在這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均為0，表明這些變異非常罕見(jiàn)。然后使用4個(gè)在線突變致病性預(yù)測(cè)分析軟件Polyphen-2、SIFT、Mutation Taster和FATHMM對(duì)12個(gè)變異進(jìn)行生物信息學(xué)層面的突變致病性分析，得到每個(gè)變異的致病性預(yù)測(cè)(表1)。

表1 對(duì)高血壓急癥患者測(cè)序發(fā)現(xiàn)的罕見(jiàn)變異的生物信息學(xué)分析

涉及PPARG、NF1、KLHL 3個(gè)基因的4個(gè)變異被≥3個(gè)軟件預(yù)測(cè)為可能致病。特別是PPARG基因突變(c.1276C>G；p.P426A)同時(shí)被4個(gè)在線突變致病性分析軟件預(yù)測(cè)為致病性突變，且該位點(diǎn)突變的頻率極低，在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)的東亞人種外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)中尚未有該位點(diǎn)突變的記錄，以上均提示該基因突變很可能與導(dǎo)致高血壓急癥的致病突變相關(guān)。對(duì)致病突變進(jìn)行病例回顧及妊娠期化驗(yàn)檢查發(fā)現(xiàn)，4例患者的風(fēng)濕免疫化驗(yàn)結(jié)果均為陰性，不考慮由免疫系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的高血壓急癥，因高血壓急癥或胎兒宮內(nèi)窘迫(胎心型)以剖宮產(chǎn)終止妊娠，新生兒均存在胎兒生長(zhǎng)受限(表2)。

表2 具有致病突變的妊娠期單基因致病型高血壓患者的一般情況

討 論

大多數(shù)高血壓是行為和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，然而基因突變也被確定為原因之一。我國(guó)高血壓患者達(dá)2.43億，而難治性高血壓占10%～12%，其中繼發(fā)性高血壓占高血壓比例6%～12%。單基因高血壓是繼發(fā)性高血壓重要病因之一。目前已明確的單基因致病性高血壓有17種，其中包含40余種亞型?！秵位蜻z傳性心血管疾病基因診斷指南》中，根據(jù)受累基因的功能分為3類(lèi)：①基因突變直接影響遠(yuǎn)端腎小管的遠(yuǎn)曲小管和(或)集合管細(xì)胞的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，增加水鈉吸收，包括Liddle′s綜合征、Gordon′s綜合征、類(lèi)鹽皮質(zhì)激素增多癥和妊娠加重型高血壓；②基因突變導(dǎo)致腎上腺類(lèi)固醇合成異常，進(jìn)而造成遠(yuǎn)端腎單位的鹽皮質(zhì)激素受體異常激活，遠(yuǎn)端腎小管鈉轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)，包括家族性醛固酮增多癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥和家族性糖皮質(zhì)激素抵抗綜合征等；③以嗜鉻細(xì)胞瘤等為代表的、在腫瘤綜合征基礎(chǔ)上合并了高血壓表現(xiàn)的各種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，包括嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤、VHL綜合征、神經(jīng)纖維瘤病等[7，8]。

當(dāng)孕婦年齡≤40歲并應(yīng)用多種降壓藥物，血壓控制仍不滿(mǎn)意，臨床上除了考慮為子癇前期病情進(jìn)展，同時(shí)需要警惕是否存在單基因致病型高血壓。后者靶器官損害通常較嚴(yán)重，發(fā)病年齡輕，治療困難，常呈現(xiàn)家族聚集性發(fā)病，部分患者為散發(fā)性基因突變，其確診需基因檢測(cè)，而常見(jiàn)的各項(xiàng)臨床生化檢查只能作為輔助手段。這些致病基因主要與調(diào)節(jié)血壓的激素合成、代謝以及激素作用的靶細(xì)胞位點(diǎn)有關(guān)，集中在腎臟和腎上腺的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)。而單基因致病型高血壓治療必須個(gè)性化治療，針對(duì)獨(dú)特的鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素或交感神經(jīng)通路紊亂給予對(duì)癥治療。對(duì)于年齡<35歲的高血壓患者，一旦有高血壓家族遺傳史，且具有低血漿腎素活性特征時(shí)，應(yīng)考慮進(jìn)行基因篩查。基因篩查有助于早期病因診斷，行針對(duì)性的特異治療；并且能夠通過(guò)篩查直系親屬，發(fā)現(xiàn)攜帶突變的家庭成員，達(dá)到早期診斷、早期針對(duì)性治療和改善預(yù)后的目的[2]。目前尚未有妊娠期單基因致病型高血壓的相關(guān)研究。

本研究應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片發(fā)現(xiàn)2例早發(fā)型重度子癇前期患者存在抑癌基因NF1突變(c.8093C>T，c.8345C>T)，而NF1突變導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤病1型是神經(jīng)纖維瘤病中最常見(jiàn)的類(lèi)型，主要表型包括神經(jīng)纖維瘤、典型的牛奶咖啡斑的色素沉著、癲癇或智力障礙[9～11]。一項(xiàng)針對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)認(rèn)為，NF1基因可能與血管性疾病的發(fā)生存在因果關(guān)系[12]。本研究中雖然這2例早發(fā)性重度子癇前期患者存在NF1基因突變(c.8093C>T，c.8345C>T)，但無(wú)典型的臨床表型，故NF1基因的某些突變類(lèi)型及突變基因產(chǎn)物的比例與臨床表型關(guān)系尚不清楚。NF1基因突變檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性并不能預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度或并發(fā)癥。

既往研究表明，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs，PPARG)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9 mRNA表達(dá)，阻礙胎盤(pán)雌激素和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成分泌，可導(dǎo)致胎盤(pán)缺血缺氧，胎兒生長(zhǎng)受限[13]。本研究中1例既往因孕中期慢性高血壓和胎兒畸形引產(chǎn)的29歲孕婦，此次妊娠自早孕期血壓進(jìn)行性升高，伴有低鉀血癥，孕32周因?yàn)楦哐獕杭卑Y并發(fā)重度子癇前期行剖宮產(chǎn)終止妊娠，胎兒生長(zhǎng)受限；基因檢測(cè)為錯(cuò)義突變，c.1276C>G，氨基酸發(fā)生改變?yōu)閜.P426A，是PPARG1異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄子4發(fā)生變異，與變異2在5′非翻譯區(qū)和5′編碼區(qū)有所不同。患者低鉀血癥推測(cè)可能由于PPARG基因突變，導(dǎo)致ATP敏感鉀通道活性增加引起，目前正在進(jìn)行家系驗(yàn)證中。

本研究發(fā)現(xiàn)1例慢性高血壓并發(fā)早發(fā)性高血壓患者KLHL3(Kelch-like 3)基因發(fā)生雜合突變，使堿基由G變?yōu)锳，氨基酸p.A38T發(fā)生改變。而KLHL3基因是引起以高血壓、高鉀血癥而腎小球?yàn)V過(guò)率正常為特征Gordon綜合征的重要組成基因之一。作為常染色體顯性遺傳疾病，Gordon綜合征發(fā)病基因包括WNK1(With-No-Lysine 1)、WNK4(With-No-Lysine 4)、CUL3(cullin-3)和KLHL3 4個(gè)基因。KLHL3/CUL3泛素連接酶可以降解WNK1、WNK4調(diào)節(jié)血壓[14,15]。KLHL3中成分的突變引起持續(xù)性腎臟鈉重吸收增加和鉀離子的分泌受損，導(dǎo)致高血壓和高鉀血癥。Ishizawa等[16]研究發(fā)現(xiàn)KLHL3泛素連接酶復(fù)合物參與低鉀介導(dǎo)的腎臟中Na-Cl協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激活。本研究中發(fā)現(xiàn)1例KLHL3基因堿基由G變?yōu)锳，氨基酸p.A38T發(fā)生改變，考慮其代謝產(chǎn)物通過(guò)影響泛素連接酶，調(diào)整血管緊張素信號(hào)通路，并導(dǎo)致Na-Cl持續(xù)性重吸收，同時(shí)損害鉀離子的分泌。既往研究表明無(wú)論是KLHL3s433N還是KLHL3s433G的替代都可以導(dǎo)致高血壓和高鉀血癥，而氫氯噻嗪及限鈉飲食能夠有效糾正患者的電解質(zhì)紊亂和高血壓[17]。給予該患者氫氯噻嗪降壓和限鈉飲食治療后血壓控制理想，并囑其避免口服高鹽、高鉀食物。

綜上所述，本研究應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片對(duì)妊娠期單基因致病型高血壓進(jìn)行研究，以亞洲人群的頻率<0.001為標(biāo)準(zhǔn)，在11例患者中發(fā)現(xiàn)12個(gè)不同的基因變異，均為錯(cuò)義突變、雜合突變。突變致病型預(yù)測(cè)分析軟件發(fā)現(xiàn)PPARG、NF1、KLHL 3個(gè)基因的4個(gè)DNA變異可能與疾病相關(guān)。其中PPARG基因突變(c.1276C>G)位點(diǎn)突變頻率極低，在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中未有該位點(diǎn)突變記錄。本研究單基因致病型高血壓發(fā)生率明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道率，考慮與筆者醫(yī)院為全國(guó)孕產(chǎn)婦危重癥搶救中心，病情危重的妊娠期高血壓病例集中有關(guān)，且此項(xiàng)研究應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片的基因檢測(cè)，診斷明確。

對(duì)于妊娠期高血壓疾病，目前臨床上強(qiáng)調(diào)的主要是妊娠期血壓監(jiān)測(cè)，但對(duì)既往有高血壓不良孕產(chǎn)史患者的隨訪及再次妊娠患者的指導(dǎo)目前還欠缺。目前有相當(dāng)數(shù)量妊娠期高血壓急癥患者或者既往因血壓高，應(yīng)用多種降壓藥物無(wú)法控制血壓，不得不在孕中晚期終止妊娠患者，無(wú)法期待至胎兒存活且早產(chǎn)兒常合并胎兒生長(zhǎng)受限或各系統(tǒng)發(fā)育不完善而預(yù)后欠佳者，有迫切的再次生育的要求。應(yīng)對(duì)此類(lèi)患者進(jìn)行病因診斷、完善免疫系統(tǒng)疾病、機(jī)體是否存在血液高凝狀態(tài)的同時(shí)，應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)芯片進(jìn)行基因診斷，明確是否存在單基因致病型高血壓。這將有助于進(jìn)一步闡明妊娠期高血壓疾病發(fā)生的分子機(jī)制，可為妊娠期高血壓急癥的防治提供新思路，為妊娠期急進(jìn)型高血壓治療尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，一方面可以明確病因，給予用藥指導(dǎo)；另一方面可以提前預(yù)防，改善妊娠結(jié)局。這對(duì)母嬰近遠(yuǎn)期合并癥的預(yù)防、提高人口素質(zhì)具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。