膠質(zhì)瘤患者血液CD26表達(dá)及其臨床意義

張玉松 韓亞迪 馮 穩(wěn)

CD26被稱為二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-IV，DPP4)，是DPP4基因編碼的一個(gè)具有酶活性跨膜蛋白[1]?；A(chǔ)與臨床研究結(jié)果表明，CD26參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，如肺癌、胃癌[2，3]。CD26可以透過(guò)細(xì)胞膜分泌到膜外，成為可溶性CD26發(fā)揮作用。因此，CD26可作為一個(gè)新型的腫瘤標(biāo)志物，參與腫瘤免疫治療[4]。課題組前期研究顯示，CD26水平在大鼠C6膠質(zhì)瘤模型腦標(biāo)本中表達(dá)增加，提示其在膠質(zhì)瘤發(fā)生中扮演重要角色[5]。一些臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，CD26與血糖平衡調(diào)節(jié)、酶的活性以及炎癥通路密切相關(guān)[1]。本研究旨在探討CD26在WHO不同病理分級(jí)膠質(zhì)瘤患者血中的表達(dá)變化并分析其臨床病理參數(shù)的關(guān)系，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)探討CD26參與疾病過(guò)程的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

材料與方法

1.標(biāo)本來(lái)源:收集2016年1月～2019年12月來(lái)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的70例膠質(zhì)瘤患者血液樣本，其中WHOⅠ級(jí)9例(毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤)，WHO Ⅱ級(jí)29例(彌漫性星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，WHO Ⅲ級(jí)24例(間變性星形細(xì)胞瘤和間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，WHO Ⅳ級(jí)8例(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。所有患者病理均由兩名神經(jīng)病理學(xué)家根據(jù)2016版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類進(jìn)行組織學(xué)診斷，并從科室內(nèi)網(wǎng)下載每個(gè)患者的臨床信息。同時(shí)將2019年來(lái)醫(yī)院體檢的健康人20例作為對(duì)照組。本研究獲得鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得患者知情同意。

2.ELISA方法：ELISA方法檢測(cè)血清中CD26變化水平。對(duì)采集的膠質(zhì)瘤患者組和健康對(duì)照組血液樣本行3000r/min，離心20min后取上清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。CD26 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司)上于450nm處讀取數(shù)值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白濃度，并取平均值。

3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(qRT-PCR)檢測(cè)血液中CD26 基因水平:提取膠質(zhì)瘤患者組和對(duì)照組全血樣本的總RNA，利用PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化，北京)立即將RNA反轉(zhuǎn)錄(冰上進(jìn)行)成 cDNA 作為模板，加樣后混勻離心。根據(jù)每個(gè)基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異的熒光定量PCR引物檢測(cè)各個(gè)基因的表達(dá)情況；嚴(yán)格按照天根生化熒光定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作方法操作。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃ 1min，94℃變性 30s，退火15s，68℃延伸15s，40個(gè)循環(huán)。本研究涉及CD26引物均使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，選取 β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參基因。數(shù)據(jù)由美國(guó)伯樂(lè) IQ5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀產(chǎn)生和分析。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)融解曲線鑒定為單一產(chǎn)物，PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔcT法計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 CD26的引物序列

4.蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:選擇蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)String(http：∥string?db.org/cgi/input.pl)，對(duì)CD26蛋白質(zhì)相互作用間信息進(jìn)行分析并構(gòu)建分子PPI網(wǎng)絡(luò)。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)研究CD26參與的蛋白質(zhì)相互作用功能網(wǎng)絡(luò)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

5.免疫組化:兔單抗ATRX抗體(1∶500稀釋，ab97508)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Evision兩步法染色。判讀標(biāo)準(zhǔn)：每張切片隨意選取5個(gè)高倍鏡，計(jì)算核陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目>10%為陽(yáng)性，ATRX表達(dá)；≤10%為陰性，ATRX失表達(dá)。

6.IDH1/2測(cè)序分析：收集70例膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本送到上海生工公司進(jìn)行測(cè)序來(lái)檢測(cè)IDH1/2突變與否，根據(jù)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行操作。

結(jié) 果

1.70例膠質(zhì)瘤患者臨床資料分析:收集70例膠質(zhì)瘤患者，其中WHOⅠ級(jí)9例(毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤)，WHOⅡ級(jí)29例(彌漫性星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，WHO Ⅲ級(jí)24例(間變性星形細(xì)胞瘤和間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，WHO Ⅳ級(jí)8例(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。男性患者39例，女性患者31例，患者年齡3～82歲，平均年齡43.09±4.57歲。其他臨床信息可從醫(yī)院內(nèi)網(wǎng)獲的。健康對(duì)照組20例，男性10例，女性10例，平均年齡45.90±4.28歲，既往無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病或腫瘤史。膠質(zhì)瘤患者與對(duì)照組在年齡與性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤患者血清CD26水平變化情況：膠質(zhì)瘤患者血清CD26水平(Ⅰ級(jí)：496.10±16.67pg/ml，Ⅱ級(jí)：553.10±12.81pg/ml，Ⅲ級(jí)：625.90±14.78pg/ml,Ⅳ級(jí)：846.10±20.91pg/ml)顯著高于健康對(duì)照組(408.30±10.31pg/ml,P=0.000)，其中，Ⅱ級(jí)與Ⅰ級(jí)、Ⅲ級(jí)與Ⅱ級(jí)、Ⅳ級(jí)與Ⅲ級(jí)比較，P均<0.05。

3.膠質(zhì)瘤患者血清CD26水平與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系：膠質(zhì)瘤患者血清中CD26水平顯著高于對(duì)照組(P=0.000)。隨著膠質(zhì)瘤WHO病理分級(jí)的增高，血清CD26水平也隨之增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P=0.000)。血清CD26水平變化與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)具有相關(guān)性。

4.膠質(zhì)瘤患者血清CD26水平與臨床病理特征的關(guān)系：膠質(zhì)瘤患者血清CD26水平與IDH1/2的狀態(tài)密切相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、原發(fā)腫瘤直徑、部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ATRX狀態(tài)、放化療以及癲癇發(fā)生病史無(wú)關(guān)(P>0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 膠質(zhì)瘤患者血清CD26水平與臨床病理特征的關(guān)系

5.膠質(zhì)瘤患者血液中CD26 mRNA水平變化:qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組患者CD26 mRNA水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增加，CD26 mRNA水平也顯著增加(P<0.01)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 qRT-PCR結(jié)果顯示不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組患者血CD26 mRNA水平增加*P<0.01，**P=0.000

6.CD26與其他蛋白質(zhì)之間PPI分析:采用String (http:∥string-db.org/)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)信息進(jìn)行分析,PPI分子網(wǎng)絡(luò)表明， CD26 與 INS、GIP、SLC5A2、SLC5A4、GCG、GLP1R、ADA、MME、ACE2、PRCP這10個(gè)蛋白的相互作用較多, 詳見(jiàn)圖2。

圖2 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)研究與CD26(DPP4)相關(guān)的PPI分子網(wǎng)絡(luò)圖

7.CD26的GO功能注釋和KEGG通路分析：采用GO和KEGG富集通路數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD26參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，CD26與機(jī)體生物學(xué)功能和細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，詳見(jiàn)表3。

表3 CD26的GO和KEGG通路富集分析

討 論

膠質(zhì)瘤又稱神經(jīng)膠質(zhì)瘤，是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤，具體表現(xiàn)為侵襲性生長(zhǎng)，對(duì)人類身體健康危害程度較大，臨床主要手術(shù)切除并輔以放化療治療。CD26(DPP4)是一種具有酶活性的跨膜細(xì)胞表面蛋白，與T淋巴細(xì)胞的活化有關(guān)。最近，人們發(fā)現(xiàn)了CD26的可溶形式，其缺少細(xì)胞質(zhì)區(qū)域和跨膜區(qū)域；CD26除了能夠降解腸促胰島素，還能夠調(diào)節(jié)多種趨化因子和神經(jīng)肽Y(nerve peptide Y，NPY)。在肝細(xì)胞性肝癌中，抑制CD26酶活性可以增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞趨化因子細(xì)胞生物軸活性，改善腫瘤免疫功能[6]。CD26抑制劑也可以抑制腫瘤血管生成，激活淋巴細(xì)胞趨化因子生物軸降低小鼠肝細(xì)胞癌[7]。研究顯示，外周血中CD26通過(guò)Caveolin-1蛋白共同刺激淋巴細(xì)胞分化在糖尿病發(fā)生、血壓調(diào)節(jié)及腎臟疾病發(fā)生中扮演重要角色[8]。此外，CD26在甲狀腺乳頭狀癌高水平表達(dá)，是其較有希望的腫瘤標(biāo)志物[9]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，血清CD26水平在膠質(zhì)瘤患者中顯著增加，與上述結(jié)果保持一致[8,9]。此外，分析CD26水平與患者的臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，血清CD26水平與IDH1/2的狀態(tài)密切相關(guān)，與年齡、性別、原發(fā)腫瘤直徑、部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ATRX狀態(tài)、放化療以及癲癇發(fā)生病史無(wú)關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，IDH1/2突變的膠質(zhì)瘤有較好的預(yù)后。研究結(jié)果顯示，與IDH1/2突變型比較，CD26水平在IDH1/2野生型膠質(zhì)瘤中顯著增加，提示IDH1/2突變型膠質(zhì)瘤患者有較低的CD26水平。

研究顯示，抑制CD26酶可以通過(guò)CXCL12(C-X-C motif chemokine ligand 12)/CXCR4(C-X-C receptor 4)/mTOR生物軸促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響乳腺癌代謝[10]。在乳腺癌中CD26的表達(dá)與TGF-β(transforming growth factor-β)和SDF-1(stromalcell-derived factor-1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，敲低TGF-β和SDF-1可以增加CD26的表達(dá)水平并與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)[11]。CD26的表達(dá)在胃癌發(fā)生中起重要作用，它是胃癌侵襲能力、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床病理分期以及早期預(yù)警的指標(biāo)[12]。在結(jié)腸癌中，CD26水平與性別及DPP4酶活性密切相關(guān)[13]。生物信息學(xué)方法可以提供基因水平表達(dá)以及參與的信號(hào)討論，預(yù)測(cè)疾病潛在的治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析CD26參與生命過(guò)程的信號(hào)通路及密切相關(guān)的基因功能網(wǎng)絡(luò)。數(shù)據(jù)表明，CD26參與酶活性、蛋白的分泌和消化、糖的代謝、免疫系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)等生命過(guò)程中，進(jìn)而參與疾病發(fā)生。膠質(zhì)瘤是成人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，筆者課題組前期報(bào)道CD26蛋白和mRNA水平在膠質(zhì)瘤大鼠模型標(biāo)本中表達(dá)顯著增加。此外，CD26可以依賴其酶活性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)[14]。以上研究表明，CD26可以作為新型的潛在腫瘤標(biāo)志物[4,5,15]。

本研究中膠質(zhì)瘤患者血標(biāo)本中CD26蛋白和mRNA表達(dá)增加，這與之前的數(shù)據(jù)結(jié)果相一致[5]。CD26酶抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)，說(shuō)明CD26可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。近來(lái)研究表明，CXCL12/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膠質(zhì)瘤侵襲和發(fā)展中起作用[16,17]。筆者推測(cè)CD26可以通過(guò)調(diào)控CXCL12/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤發(fā)展過(guò)程。