清熱化瘀方對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制

秦紅玲 胡躍強(qiáng) 農(nóng)必華 陳 煒 程 越 盧健鋒 譚璐璐

腦動(dòng)脈栓塞引起的缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)占所有腦卒中疾病的60%～80%，可造成局部血液供應(yīng)紊亂，導(dǎo)致高發(fā)生率和高病死率[1]。溶栓或手術(shù)以盡早恢復(fù)血流是治療IS的主要策略，但該過程常導(dǎo)致腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)損傷[2]。清熱化瘀方是治療IS的中藥復(fù)方，臨床療效確切，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，可有效改善大鼠腦I/R損傷[3～5]，但其作用機(jī)制尚不明確。大量研究證實(shí)，microRNA(miRNA)參與調(diào)控腦I/R損傷機(jī)制，可能是該病治療的新靶點(diǎn)[6]。筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-503-5p在清熱化瘀方治療腦I/R大鼠前、后存在差異表達(dá)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miR-503-5p可通過靶向抗凋亡因子Bcl-2，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[7]。提示清熱化瘀方可能通過調(diào)控miR-503-5p/Bcl-2通路，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用。故本研究以腦I/R大鼠為研究對(duì)象，基于miR-503-5p/Bcl-2通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制，進(jìn)一步探究清熱化瘀方對(duì)腦I/R大鼠腦組織損傷的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制，為清熱化瘀方的臨床應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

材料與方法

1.材料：SD大鼠(合格證號(hào)：SCXK2016-0005)由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。清熱化瘀方(共9味中藥：水牛角30g、丹參15g、赤芍15g、地龍10g、石菖蒲10g、川芎10g、郁金10g、酒大黃6g、天竺黃10g)由江陰天江藥業(yè)有限公司制備(批號(hào)：0904099)。Trizol、RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司?？贵wBcl-2、Bax購(gòu)自美國(guó)BioVision公司?？贵wcaspase-3、caspase-8、caspase-9、β-actin、山羊抗兔二抗HRP-IgG和TUNEL染色試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

2.動(dòng)物分組及處理：SD大鼠，體質(zhì)量300～400g，16～20周齡，分為正常組、假手術(shù)組、模型組、清熱化瘀方組，每組10只。除正常組外，其余各組均采用線栓法進(jìn)行處理。清熱化瘀方組灌胃清熱化瘀方劑[1.4毫升/(100克·次)]，每天2次，其濃度及等效劑量按體表面積折算。正常組、假手術(shù)組和模型組均灌胃等體積0.9% NaCl溶液。各組大鼠均正常飼養(yǎng)，自由飲水，4天后處死取缺血灶周圍腦組織進(jìn)項(xiàng)各項(xiàng)檢測(cè)分析。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理要求。

3.動(dòng)物模型建立：采用大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻(MCAO)模型，參照Longa線栓法進(jìn)行[8]。模型建立具體步驟：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，平臥固定于手術(shù)臺(tái)，頸部術(shù)區(qū)備皮、消毒，于旁正中切開長(zhǎng)2～4cm切口，鈍性分離肌肉，暴露術(shù)野，分離頸總、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈并于動(dòng)脈下備線，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，用留置針刺破頸總動(dòng)脈使血流入留置針內(nèi)，撤掉留置針，將尼龍線栓插入刺破的頸總動(dòng)脈孔，并用彎頭眼科鑷將線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)推送至大腦中動(dòng)脈起始處(進(jìn)線18～20mm可感覺到阻力)，阻斷大腦中動(dòng)脈血流，缺血2h后去除線栓再灌注，縫合切口。假手術(shù)組線栓只進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈9mm，不栓塞大腦中動(dòng)脈，去除線栓縫合切口。

4.TUNEL染色：取各組大鼠腦組織常規(guī)脫水固定，石蠟包埋，切片。按TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書操作。在400倍顯微鏡下，于缺血灶腦組織邊緣隨機(jī)選取視野，觀察切片中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核為棕色)，凋亡陽(yáng)性率(%)=單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

5.應(yīng)用RT-qPCR法檢測(cè)：采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，按操作說(shuō)明書進(jìn)行。PCR程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

6.Western blot法檢測(cè)：RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白，BCA法定量后，取80μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2h，分別孵育相應(yīng)蛋白一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜10min×4次，室溫孵育HRP標(biāo)記二抗2h，TBST振搖洗膜10min×4次。ECL試劑發(fā)光后用凝膠成像儀拍照，Image J軟件計(jì)算條帶灰度值。

結(jié) 果

1.清熱化瘀方對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響(圖1)：采用TUNEL染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡情況，與正常組比較，模型組缺血灶腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，凋亡率顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，清熱化瘀方組缺血灶腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，凋亡率顯著降低(P<0.05)，假手術(shù)組與正常組的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 TUNEL染色(×400)A.正常組；B.假手術(shù)組；C.模型組；D.清熱化瘀方組。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.清熱化瘀方對(duì)大鼠腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8及caspase-9表達(dá)的影響：詳見表2、表3、圖2。采用RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組缺血灶腦組織中Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)水顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，清熱化瘀方組缺血灶腦組織中Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)水顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組與正常組的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 大鼠腦組織中凋亡標(biāo)志蛋白的Western blot法檢測(cè)結(jié)果

表2 各組大鼠腦組織凋亡標(biāo)志物mRNA的相對(duì)表達(dá)

表3 各組大鼠腦組織凋亡標(biāo)志蛋白的相對(duì)表達(dá)

3.清熱化瘀方對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織miR-503-5p表達(dá)的影響：RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組缺血灶腦組織中miR-503-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，清熱化瘀方組缺血灶腦組織中miR-503-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組與正常組miR-503-5p表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 清熱化瘀方對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織miR-503-5p表達(dá)的影響與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05

討 論

腦I/R損傷的細(xì)胞和分子機(jī)制復(fù)雜，包括鈣離子超載、活性氧暴發(fā)、炎癥、血-腦脊液屏障破壞、凋亡基因的激活等，這些惡性循環(huán)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[9～12]。其中，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腦缺血損傷的關(guān)鍵事件[13,14]。caspase家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵執(zhí)行者。經(jīng)典細(xì)胞凋亡的激活主要通過兩條途徑進(jìn)行。其中一種是外源性途徑，其通過激活細(xì)胞表面的死亡受體(如Fas)而啟動(dòng)，導(dǎo)致caspase-8或caspase-10的激活。另一種途徑是內(nèi)源性途徑，也稱為線粒體凋亡途徑，其起源于細(xì)胞色素C的線粒體釋放和相應(yīng)的caspase-9的活化。這兩種途徑均導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，集中于caspase-3的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax是目前已知在凋亡過程中的關(guān)鍵標(biāo)志物[15]。Bax通常與Bcl-2保持平衡，參與調(diào)控線粒體膜的通透性，控制細(xì)胞色素C的釋放和caspase家族的活化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦I/R損傷后缺血灶凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，Bcl-2表達(dá)降低，Bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9表達(dá)升高，符合腦I/R損傷后神經(jīng)元凋亡機(jī)制，提示上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)，并抑制促凋亡途徑激活，是減輕腦I/R損傷的關(guān)鍵。

miRNA是一類高度保守、單股的非編碼小RNA，約有20～30個(gè)核苷酸，主要通過與目標(biāo)mRNA的3′ UTR結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[17]。并且，miRNA在IS的炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[18]。提示miRNA有望成為腦缺血診斷和預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-503-5p在IS合并糖尿病患者急性期呈高水平，是預(yù)示腦卒中嚴(yán)重程度和短期預(yù)后的潛在標(biāo)志物[19]。另外，在高糖刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和2型糖尿病大鼠的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-503-5p的水平明顯升高[20, 21]。miR-503-5p可通過靶向抑制Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[7]。最新研究表明，miR-503-5p是IS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，IS患者血漿miR-503-5p在急性期、重癥及LAA、TACI亞型中明顯升高，miR-503-5p拮抗劑可部分抑制永久性MCAO小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和ROS生成，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除miR-503-5p可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步提示miR-503-5p/Bcl-2通路在腦I/R損傷中起關(guān)鍵作用[22]。本研究通過檢測(cè)大鼠腦I/R損傷后缺血灶miR-503-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺血組織中miR-503-5p表達(dá)顯著高于正常腦組織，同時(shí)伴隨著Bcl-2的低表達(dá)，證實(shí)miR-503-5p參與了腦I/R損傷過程并起著促凋亡的作用，且作用機(jī)制與Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。

如何減少腦I/R損傷一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的問題。中醫(yī)認(rèn)為，IS屬“中風(fēng)”范疇，其病因病機(jī)多以“風(fēng)、火、痰、瘀、虛、毒”為主[23]。根據(jù)王永炎院士提出的“毒損腦絡(luò)”觀點(diǎn)，研制清熱化瘀方治療IS，并取得了良好的臨床效果。前期研究已證實(shí)，清熱化瘀方具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，還可有效降低過度自噬，清除自由基，促進(jìn)缺血半暗帶區(qū)的血管新生，減輕腦I/R損傷，保護(hù)神經(jīng)元。然而，清熱化瘀方改善腦I/R損傷的作用機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，缺血核心內(nèi)的血流減少伴隨著不可逆的神經(jīng)細(xì)胞壞死，而缺血半暗帶內(nèi)出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡在缺血后數(shù)小時(shí)內(nèi)可逆，因此抑制細(xì)胞凋亡是治療腦卒中的重要策略[15]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究清熱化瘀方的抗凋亡機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦I/R大鼠經(jīng)清熱化瘀方治療后，腦缺血組織中Bcl-2表達(dá)顯著升高，miR-503-5p、Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)及腦組織凋亡率均顯著降低，表明清熱化瘀方的抗凋亡機(jī)制與miR-503-5p/Bcl-2通路有關(guān)，其可能通過下調(diào)神經(jīng)元miR-503-5p的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，從而抑制細(xì)胞色素C的釋放和caspase家族的激活，進(jìn)而改善腦I/R損傷，保護(hù)神經(jīng)元。

綜上所述，細(xì)胞凋亡是加速腦I/R損傷的關(guān)鍵因素。本研究結(jié)果表明，清熱化瘀方可抑制腦I/R大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，且機(jī)制可能與抑制miR-503-5p、Bax及caspase家族表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)清熱化瘀方可有效減輕腦I/R損傷，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。