白酒酒醅中真菌毒素的檢測

劉曉青，張 洪，申 劍，武 婷

（山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，山西 太原 030006）

霉菌在侵染糧食谷物的過程中可產(chǎn)生各種真菌毒素，其種類很多，可達幾百種，同時化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，是目前全球范圍普遍關(guān)注的一種食品有害物[1-3]。農(nóng)作物中的霉菌污染無處不在，真菌毒素是霉菌的次生代謝產(chǎn)物，是霉菌生長所導(dǎo)致的一個重要結(jié)果[4-5]，真菌毒素可能產(chǎn)生于糧食生長、加工、貯藏等各個環(huán)節(jié)[6]，真菌毒素不僅有肝細(xì)胞毒性、生殖絮亂、中毒性腎損傷及免疫抑制等作用，還會致癌、致畸、致突變[7-8]。世界上多數(shù)國家都制定了嚴(yán)格的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)以保證食品及其相關(guān)制品的安全。

白酒是一種快速消費品，廣受國人的喜愛，其制作方式為將主要原料高粱，糖化發(fā)酵劑酒曲、酒母，經(jīng)過粉碎、蒸煮、糖化、發(fā)酵蒸餾最后獲得。在白酒的生產(chǎn)制作過程中，來自于原料、酒曲及其生產(chǎn)環(huán)境的各種霉菌不僅產(chǎn)生酶、香氣和糖化淀粉，部分有害霉菌還會產(chǎn)生對人體有害的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物，即真菌毒素[9]。

真菌毒素含量的檢測方法可分為兩大類，分別是快速檢測和確證檢測[10]?？焖贆z測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[11]、熒光定量試紙卡法[12]、適配體傳感器法[13]和膠體金試紙條法[14]等，這些方法檢測過程簡單、快速，但是有時會出現(xiàn)假陽性和假陰性，并且無法準(zhǔn)確定量。確證檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等，其中LC-MS/MS具有準(zhǔn)確性好、分辨率高、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點。李覓等[15]采用酶聯(lián)免疫吸附法對濃香型白酒生產(chǎn)過程中的各種樣品（大曲、酒醅、丟糟、黃水、基酒、成品酒）中的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和桔霉素進行了定量分析。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A在大曲、酒醅、丟糟和黃水中都有檢出，在基酒和成品酒中的含量未達到檢出水平；桔霉素在6種樣品中均未檢出。葉光斌等[16]采用ELISA試劑盒法對瀘州老窖生產(chǎn)釀造過程中的大曲、酒醅、丟糟、黃水、基酒及成品酒中的赭曲霉毒素A的含量進行檢測，結(jié)果表明，大曲、酒醅、丟糟、黃水中均有檢出，但是含量遠(yuǎn)低于國內(nèi)外食品行業(yè)的限量標(biāo)準(zhǔn)，而基酒、成品酒中并未檢出。龐曉娜等[17]結(jié)合白酒產(chǎn)品工藝，分別采用酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandemmass spectrography，HPLC-MS/MS）法對大曲及白酒生產(chǎn)中的酒醅、酒糟、基酒中進行了黃曲霉毒素B1的檢測，結(jié)果顯示，大曲、酒醅和酒糟中有黃曲霉毒素B1檢出，但是基酒中未檢出。韓現(xiàn)文[9]采用高效液相色譜（HPLC）法研究了蒸餾對酒醅中三種真菌毒素（黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）的影響，結(jié)果顯示，在蒸餾后的酒醅中檢出了這些真菌毒素，但在蒸餾酒中未檢出這三種真菌毒素。李曉頎等[18]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定白酒中黃曲霉毒素總量（G2、G1、B2、B1）的檢測方法，但是此研究只涉及到4種常見的真菌毒素。任璐等[19]在GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》方法1的基礎(chǔ)上進行了方法優(yōu)化、改進，建立了釀酒原料及白酒中黃曲霉毒素B1的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。宮小明等[20]建立了葡萄酒中赭曲霉毒素A的實時直接分析-串聯(lián)質(zhì)譜方法。汪瓊等[21]研究了液相色譜-質(zhì)譜法測定啤酒中3種伏馬毒素的可行性。

上述研究涉及到的酒及酒的生產(chǎn)原料中的真菌毒素檢測種類較少，而實際生產(chǎn)中，以糧食作為原料的釀酒過程受到的真菌毒素污染種類眾多，本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立白酒生產(chǎn)原料酒醅中31種真菌毒素的檢測方法，以期為白酒生產(chǎn)過程中真菌毒素的監(jiān)測提供前處理簡單、檢測過程用時較短、結(jié)果準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：某白酒企業(yè)，取10個批次。

31種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸銨和甲酸（色譜純）：美國Fisher公司；0.22 μm尼龍濾膜：天津博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity-Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀、Acquity UPLC BEH RPC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Masslynx色譜質(zhì)譜工作站：美國Waters公司；NEVAP-12氮吹濃縮儀：美國Organomation Associates有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；明澈-D24UV實驗室超純水系統(tǒng)：默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別取31種適量真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的31種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；用乙腈稀釋，配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為1 μg/L、5 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L。

1.3.2 樣品前處理

樣品前處理使用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）法[22-24]。本研究參考趙英蓮等[25]的方法，除使用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）粉外，還加入了石墨炭黑粉（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠粉（C18）和硫酸鎂（MgSO4），通過改變4種試劑的用量配比，極大地改善了樣品凈化效果。

稱取粉碎并過50目分樣篩后的酒醅樣品約2 g，置于50 mL離心管中，將乙腈與1%的甲酸水以85∶15（V/V）混合，用于提取樣品中的真菌毒素。將樣品在20 mL提取溶劑中勻漿2 min，振搖20 min，于6 000 r/min離心10min，吸取上清液10 mL至離心管中，加入2 g QuEChERS法混合填料（45 mg GCB+225 mg PSA+450 mg C18+1 350 mg MgSO4），渦旋混勻5 min，于8 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于40 ℃氮氣（N2）吹至約近干，加入體積分?jǐn)?shù)20%的甲醇水溶液稀釋至1 mL，設(shè)置超聲波清洗機水溫為20 ℃，超聲功率為240 W，超聲振蕩5 min，過0.22 μm微孔濾膜，放入自動進樣器樣品瓶中進行后續(xù)的分析。

1.3.3 儀器條件

高效液相色譜：流動相A為0.1 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇溶液，流動相中均含0.1%甲酸；色譜柱Acquity UPLC BEH RPC18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～2.0 min，90%A；2.0～10.0 min，90%A～30%A；10.0～10.1min，30%A～10%A；10.1～12.0 min，10%A；12.0～12.1 min，10%A～90%A；12.1～15.0 min，90%A。

質(zhì)譜：霉酚酸、交鏈孢酚單甲醚玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇采用電噴霧負(fù)離子（negative electrosprayionization，ESI-）模式，其他目標(biāo)真菌毒素為電噴霧正離子（positive electrospray ionization，ESI+）模式；毛細(xì)管電壓：ESI+為3000V，ESI-為1500V；脫溶劑溫度450℃；離子源溫度150℃；脫溶劑氣N2，流速為900 L/h；錐孔氣（N2）流速為50 L/h；采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測。

定性、定量：根據(jù)保留時間定性，采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

流動相為50∶50（V/V）的甲醇和水（甲酸0.1%），流速為0.3 mL/min，將超高效液相色譜與質(zhì)譜的連接模式調(diào)至為combine，將真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液注入質(zhì)譜。

2.1.1 優(yōu)化母離子

關(guān)閉碰撞氣，進入MS-SCAN模式尋找母離子，正電離模式下加合方式為[M+H]+或[M+NH4]+，負(fù)電離模式下加合方式為[M-H]-。以5 V為步進手動優(yōu)化錐孔電壓，使目標(biāo)物的母離子響應(yīng)值達到最高。

2.1.2 優(yōu)化子離子

打開碰撞氣，進入MS/MS模式對母離子進行MRM子離子掃描，手動優(yōu)化碰撞能量獲得子離子峰，選擇信噪比較高的兩個子離子分別作為定量和定性離子。31種真菌毒素的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 31種真菌毒素的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Mass spectrometry condition parameters of 31 mycotoxins

續(xù)表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限、定量限

以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立了31種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以定性通道的3倍信噪比（S/N）確定化合物的檢出限（limit of detection，LOD），以定量通道的10倍信噪比（S/N）確定化合物的定量限（limit of quantitation，LOQ），結(jié)果見表2。由表2可知，31種真菌毒素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.991～0.999之間。檢出限和定量限分別為0.10～5.00 μg/kg和0.4～16.5 μg/kg。

表2 31種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Standard working curves,correlation coefficients,detection and quantitation limits of 31 mycotoxins

續(xù)表

續(xù)表

2.3 回收率和精密度實驗

取酒醅空白樣品，做4個質(zhì)量濃度的加標(biāo)回收試驗，濃度分別為方法定量限及定量限5倍、10倍和25倍，每個濃度做5個平行，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。由表3可知，真菌毒素在4個添加質(zhì)量濃度下的平均回收率為83.1%～108.7%，回收率實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.5%～9.6%之間。

表3 31種真菌毒素的回收率Table 3 Recovery rates deviations of 31 mycotoxins

續(xù)表

2.4 樣品測定

利用所建方法對10個酒醅樣品進行檢測，測定結(jié)果見表4。其中糧食中常見的黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物、玉米赤霉毒素、赭曲霉毒素均有檢出，而伏馬毒素、桔青霉素、霉酚酸、青霉酸、渥曼青霉素、交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚、麥角胺等在樣品中未檢出。編號為4、7、9、10的樣品無一種真菌毒素檢出，編號為1、5、6、8的樣品有1～2種真菌毒素檢出，而2號和3號樣品中分別檢出5種、6種真菌毒素。

表4 酒醅樣品中真菌毒素的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of mycotoxins in fermented grains samples

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究建立了白酒生產(chǎn)原料中31種真菌毒素含量的LC-MS/MS法，其檢測范圍覆蓋了常見的糧食作物中的真菌毒素及其相關(guān)代謝產(chǎn)物。本方法采用外標(biāo)法定量，相關(guān)系數(shù)R2在0.991～0.999之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好；平均回收率為83.1%～108.7%，回收率實驗結(jié)果的RSD為2.5%～9.6%；檢出限為0.1～5.0 μg/kg；定量限為0.4～16.5 μg/kg，可滿足白酒生產(chǎn)過程中原料的檢測要求。

本研究對隨機采樣的10個酒醅樣品進行了31種真菌毒素檢測。其結(jié)果表明同一樣品會受到不同種類霉菌的侵染，從而檢出多種真菌毒素，同時在糧食污染中常見的真菌毒素，例如：黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素、赭曲霉毒素在酒醅中存在。本研究檢測真菌毒素的范圍更廣，種類更多，發(fā)現(xiàn)除去常見的真菌毒素，還有T-2毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙?；撗跹└牭毒┐?、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雜色曲霉素等毒素的檢出，而關(guān)于31種真菌毒素是否會從酒醅中遷移至白酒中還有待進一步研究。