鹽濃度對(duì)自制香腸理化因子及原核微生物群落多樣性的影響

孫 筱

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

香腸是我國(guó)傳統(tǒng)的腌臘肉制品，通常由攪碎的生豬肉、鹽、糖、白酒、料酒等原料在自然環(huán)境下發(fā)酵25～30 d制成[1]。香腸因具有醇香可口、外形美觀、色澤鮮艷、皮薄肉嫩等特點(diǎn)，深受廣大中國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。香腸在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)歷了多種微生物的更迭及復(fù)雜的物理化學(xué)變化，而香腸的發(fā)酵會(huì)受到鹽度和溫度等工藝條件的影響。鹽作為重要的配料，一直被用來(lái)改善咸味和延長(zhǎng)肉制品保質(zhì)期。鹽可以抑制發(fā)酵過(guò)程中有害微生物的生長(zhǎng)代謝。此外，鹽也能降低乳酸菌的生物量和代謝速率[3]。因此，鹽可以直接或間接地影響香腸發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)，從而影響香腸的品質(zhì)特征。ROSEIRO L C等[4]研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，6%鹽濃度的葡式干發(fā)酵香腸相比3%鹽濃度的香腸在成熟后具有更低的pH值和水分含量。黃鄭朝等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同工藝和地域的傳統(tǒng)發(fā)酵香腸的微生物組成存在差異。此外，田星等[6]研究發(fā)現(xiàn)，食鹽添加量為3%時(shí)，香腸出品率和保水性最好。

16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析可以全面解析傳統(tǒng)釀造食品的微生物群落組成，從而了解各種釀造微生物的發(fā)酵功能。許多研究表明，香腸發(fā)酵初期主要以弧菌屬（Vibrio）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobater）、腸桿菌屬（Enterobacter）、耶爾森菌屬（Yersinia）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）為主，而后期則以乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為主[2，7]。香腸發(fā)酵作為一種典型的厭氧發(fā)酵微生態(tài)系統(tǒng)，有利于乳酸菌等厭氧微生物的增殖。研究表明，明串珠菌屬（Leuconostoc）是低鹽香腸發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)微生物，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，乳桿菌屬（Lactobacillus）為低鹽香腸后期的優(yōu)勢(shì)菌群[8-9]。此外，DI GIOIA D等[10]研究發(fā)現(xiàn)，意大利發(fā)酵香腸中的乳酸菌可以代謝碳水化合物生成有機(jī)酸，并且產(chǎn)生細(xì)菌素抑制其他病原菌的生長(zhǎng)繁殖。

本研究基于16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)探究鹽濃度對(duì)自制香腸原核微生物多樣性及理化因子的影響，揭示不同鹽濃度處理下香腸原核微生物群落的結(jié)構(gòu)組成差異，通過(guò)冗余分析（redundancy analysis，RDA）確定理化因子與原核微生物群落的關(guān)系。為探明自制香腸原核微生物多樣性、不同鹽濃度對(duì)香腸原核微生物多樣性的影響及香腸發(fā)酵微生態(tài)調(diào)控提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮生豬肉、腸衣、食鹽、糖：市售。

硝酸銀、氯化鈉、鉻酸鉀、碘化鉀、乙酸、硫代硫酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PowerSoil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國(guó)Mobio公司；Q5高保真DNA聚合酶：英國(guó)NEB公司；細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：廣州基迪奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10型pH計(jì)：德國(guó)Sartorius公司；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Illumina Miseq PE250型測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香腸的制作

參考WANG X H等[7]的工藝制作香腸，具體方法如下：將新鮮生豬肉分為瘦肉和肥肉，切成2.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的塊狀，分別加入3%蔗糖、2%白酒、1%料酒和1%醬油，最后加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的食鹽（不添加食鹽：Z組；添加食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%：T組；添加食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%：F組；添加食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%：S組），充分混勻，將混合物裝入直徑為10 cm的天然腸衣中。將香腸置于10～15 ℃的環(huán)境進(jìn)行自然發(fā)酵30 d。在發(fā)酵完成后收集各組香腸樣本，并儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中，用于DNA提取及理化因子測(cè)定。

1.3.2 理化指標(biāo)分析

使用pH計(jì)測(cè)定香腸樣品的pH值；參照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》測(cè)定水分的含量[11]；參照國(guó)標(biāo)GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測(cè)定》測(cè)定氯化鈉的含量[12]；參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》測(cè)定過(guò)氧化值[13]。

1.3.3 DNA提取與Miseq高通量測(cè)序

1.3.4 序列分析

將測(cè)序數(shù)據(jù)根據(jù)條形碼進(jìn)行劃分，并使用FLASH軟件[14]進(jìn)行拼接，隨后使用Trimmomatic軟件[15]過(guò)濾低質(zhì)量的序列，利用UCHIME軟件[16]去除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)USEARCH軟件[17]在相似性97%的水平上進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，得到代表序列。使用Silva 138數(shù)據(jù)庫(kù)[18]對(duì)代表序列進(jìn)行比對(duì)注釋，生成不同分類水平上的物種豐度表，并刪除不能注釋到門(mén)水平的OTU?；贠TU表計(jì)算各樣品的α-多樣性指數(shù)及各注釋水平的相對(duì)豐度。使用R軟件實(shí)現(xiàn)未加權(quán)（unweighted）UniFrac距離算法的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）與冗余分析。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有柱狀圖均用Graphpad Prism軟件繪制。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05 時(shí)認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽濃度對(duì)香腸理化性質(zhì)的影響

不同鹽濃度對(duì)香腸pH、水分含量、鹽度和過(guò)氧化值的影響見(jiàn)圖1。

圖1 鹽濃度對(duì)香腸pH值（A）、水分含量（B）、鹽度（C）和過(guò)氧化值（D）的影響Fig.1 Effect of salt concentration on pH value (A),moisture contents (B),salinity (C) and peroxide value (D) of sausage

由圖1可知，相比Z組，添加食鹽均會(huì)顯著降低香腸pH（P＜0.05），而F組pH最低，為5.84，與S組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。鹽會(huì)抑制有害微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生胺、氨等堿性物質(zhì)[19]。此外，鹽會(huì)促進(jìn)乳酸菌的大量繁殖分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致產(chǎn)品pH下降[19]。水分含量隨著鹽濃度的升高而降低。相比Z組，添加食鹽均會(huì)顯著降低香腸的水分含量（P＜0.05），但F和S組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Z、T、F和S組的鹽度分別約為0、1.71%、3.46%和5.58%。過(guò)氧化物是脂類氧化的第一個(gè)中間產(chǎn)物，其性質(zhì)極不穩(wěn)定，可分解為醛、酮及酸等小分子物質(zhì)[20]，因此過(guò)氧化值可反映香腸受到氧化的程度。Z組的過(guò)氧化值最高，可達(dá)25.12 mmol/kg，顯著高于T、F和S組（P＜0.05），而T、F和S組的過(guò)氧化值在18.59～19.76 mmol/kg之間，表明鹽可以降低香腸的過(guò)氧化值。過(guò)氧化值過(guò)高會(huì)使香腸產(chǎn)生哈敗味，但適量范圍內(nèi)的過(guò)氧化值有益于香腸獨(dú)特風(fēng)味的形成[21]。

2.2 鹽濃度對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)與α-多樣性的影響

不同鹽濃度對(duì)香腸測(cè)序數(shù)據(jù)和α-多樣性的影響見(jiàn)表1。由表1可知，不同鹽濃度香腸樣品（12個(gè)）的Illumina Miseq測(cè)序原始序列經(jīng)過(guò)樣本拆分、拼接和過(guò)濾后共獲得653 001條優(yōu)質(zhì)序列，且各組樣品的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)目無(wú)顯著差異（P＜0.05）。香腸樣品的測(cè)序覆蓋率均在97%以上，且各組樣品之間無(wú)顯著差異（P＜0.05），表明測(cè)序結(jié)果足以表征香腸中原核微生物群落的多樣性。與Z組相比，T組、F組和S組具有較少的OTU和Chao1指數(shù)（P＜0.05），說(shuō)明鹽會(huì)抑制不耐鹽微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而改變香腸內(nèi)的原核微生物群落結(jié)構(gòu)。該結(jié)果與GAN X等[22]研究結(jié)果相一致。此外，除T組的Simpson指數(shù)之外，T組、F組和S組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著低于Z組（P＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明鹽的加入會(huì)降低香腸內(nèi)的原核微生物的物種多樣性。OTU、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均存在鹽濃度抑制性，隨著鹽度的不斷增加，這些α-多樣性參數(shù)均呈下降趨勢(shì)，但F組和S組的α-多樣性參數(shù)均無(wú)顯著差異（P＜0.05）。上述結(jié)果與圖1的結(jié)果相一致，推測(cè)這種現(xiàn)象與香腸發(fā)酵環(huán)境有關(guān)，食鹽添加量會(huì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)，從而改變?nèi)郝洇?多樣性[22]。

表1 鹽濃度對(duì)香腸原核微生物群落序列數(shù)量和α-多樣性參數(shù)的影響Table 1 Effect of salt concentration on sequence numbers and α-diversity parameter of prokaryotic microbial communities of sausage

2.3 鹽濃度對(duì)β-多樣性的影響

基于未加權(quán)UniFrac距離算法將OTUs縮放至距離矩陣中，隨后使用PCoA比較不同鹽濃度香腸內(nèi)原核微生物群落的差異。不同鹽濃度對(duì)香腸β-多樣性的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，PCoA第一軸和第二軸顯示物種累積百分比方差值分別為90.54%和2.69%?？偟膩?lái)說(shuō)，93.23%的物種差異可以用兩個(gè)軸來(lái)解釋。不同鹽濃度香腸樣品中原核微生物群落結(jié)構(gòu)的組間差異顯著（不同鹽濃度香腸樣品在其投影平面上的距離較遠(yuǎn)），尤其是Z組和其他組之間的差異較大。上述結(jié)果表明不同鹽濃度香腸內(nèi)原核微生物類群呈現(xiàn)出明顯的組成差異，與CHEN J X等[23]研究結(jié)果相一致。

圖2 鹽濃度對(duì)香腸原核微生物群落β-多樣性的影響Fig.2 Effect of salt concentration on β-diversity of prokaryotic microbial communities of sausage

2.4 鹽濃度對(duì)原核微生物群落組成與結(jié)構(gòu)的影響

不同鹽濃度對(duì)香腸內(nèi)原核微生物群落門(mén)水平的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，經(jīng)OTUs注釋，所有樣品中共檢測(cè)到12個(gè)可鑒定門(mén)，其中最主要的門(mén)是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、彎曲桿菌門(mén)（Campilobacterota）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）。厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)在香腸中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，二者之和占總相對(duì)豐度的98%以上。隨著鹽度的不斷增加，厚壁菌門(mén)的平均相對(duì)豐度從63.52%升高至88.81%；而變形菌門(mén)的平均相對(duì)豐度則持續(xù)降低，從34.36%降低至10.01%。上述結(jié)果表明，鹽主要是通過(guò)改變厚壁菌門(mén)與變形菌門(mén)的比例來(lái)調(diào)節(jié)香腸內(nèi)原核微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖3 鹽濃度對(duì)香腸原核微生物群落門(mén)水平的影響Fig.3 Effect of salt concentration on phylum level of prokaryotic microbial communities of sausage

不同鹽濃度對(duì)香腸內(nèi)原核微生物群落屬水平的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，基于層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）可將所有樣品劃分為2個(gè)簇，Z組樣品單獨(dú)聚為1簇（Ⅰ），其他組樣品聚為另一簇（Ⅱ）；第Ⅱ簇又可以分為3個(gè)亞簇，T組樣品聚在第ⅰ亞簇，S組樣品聚在第ⅱ亞簇，F(xiàn)組樣品聚在第ⅲ亞簇，該結(jié)果與圖2的結(jié)果相一致，說(shuō)明鹽會(huì)顯著改變香腸樣品中原核微生物的組成。在屬水平上，香腸中較多的是乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、弧菌屬（Vibrio）、乳球菌屬（Lactococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）。弧菌屬和不動(dòng)桿菌屬是腐敗致病菌，其在Z組中相對(duì)豐度分別為18.66%和7.49%，而其他添加食鹽組的樣本中弧菌屬和不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度范圍分別為1.19%～7.34%和0.23%～4.22%，與Z組差異顯著（P＜0.05）?；【鷮偈鞘称分械闹虏【?，會(huì)引發(fā)腹瀉、嘔吐、頭痛等[24]。不動(dòng)桿菌屬是肉制品中常見(jiàn)的腐敗菌之一，具有不耐酸和不能利用葡萄糖等特征[25]。

圖4 鹽濃度對(duì)香腸原核微生物群落屬水平的影響Fig.4 Effect of salt concentration on genus level of prokaryotic microbial communities of sausage

歐文氏菌屬（Erwinia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Malaciobacter、假單胞菌屬（Pseudomonas）和耶爾森氏菌屬（Yersinia）主要在Z組中富集，隨著鹽度的不斷升高，這些微生物的平均相對(duì)豐度持續(xù)降低。乳桿菌屬是香腸中占比最大的微生物，其相對(duì)豐度在30.29%～58.15%。相比Z組，添加食鹽可顯著增加乳桿菌屬相對(duì)豐度（P＜0.05），其F組中乳桿菌屬的相對(duì)豐度最高。乳酸菌可能來(lái)源于肉類和自然環(huán)境，可將肉類中的小分子糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類化合物，賦予香腸柔和的酸感[26]。此外，乳酸菌可通過(guò)蛋白水解系統(tǒng)將發(fā)酵基質(zhì)中可溶性蛋白分解短肽和氨基酸等小分子代謝產(chǎn)物，從而賦予產(chǎn)品獨(dú)特的鮮味特征[27]。

魏斯氏菌屬相對(duì)豐度隨鹽度的不斷增加呈逐漸升高的趨勢(shì)，在Z組中相對(duì)豐度最低，僅為3.89%；而在T組、F組和S組中分別可達(dá)12.73%、13.76%和23.90%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬。魏斯氏菌屬具有耐鹽等特性，且可以代謝碳水化合物，為其自身生長(zhǎng)繁殖提供能量[2]。此外，魏斯氏菌屬和乳桿菌屬是互利共生關(guān)系，魏斯氏菌屬可以合成葡萄聚糖、異麥芽低聚糖等低聚糖來(lái)促進(jìn)乳桿菌屬中益生菌的增長(zhǎng)[28]，導(dǎo)致乳桿菌屬成為香腸中豐度最高的優(yōu)勢(shì)屬，而乳桿菌屬產(chǎn)生的酸性代謝物質(zhì)會(huì)抑制不耐酸微生物的生長(zhǎng)繁殖，減弱與魏斯氏菌屬對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)。鹽單胞菌屬（Halomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、鹽弧菌屬（Salinivibrio）和四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）的變化趨勢(shì)與魏斯氏菌屬（Weissella）的變化相一致，其在Z組的相對(duì)豐度分別為0.38%、0.13%、0和0，而在S組的相對(duì)豐度分別為3.23%、5.25%、1.21%和3.33%。鹽單胞菌屬和片球菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)[29]。四聯(lián)球菌屬?gòu)V泛存在與含鹽的腌制類發(fā)酵食品中，可參與氨基酸的合成及生成醛、醇、酮和酯等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，從而提升發(fā)酵食品的風(fēng)味和口感[29]。

2.5 理化因子與原核微生物群落的相關(guān)性

理化因子是影響釀造食品微生物群落組成的主要因素。在本研究中，冗余分析被用來(lái)辨別香腸原核微生物群落和理化因子之間的相關(guān)性。理化因子與原核微生物群落的相關(guān)性見(jiàn)圖5。由圖5可知，理化因子對(duì)原核微生物群落結(jié)構(gòu)前兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)軸的解釋貢獻(xiàn)率分別為60.46%和10.64%，可將不同鹽度香腸樣品較好的區(qū)分開(kāi)。多個(gè)理化因子共同影響香腸中原核微生物群落結(jié)構(gòu)，其中Z組原核微生物群落與水分含量、pH值、過(guò)氧化值呈正相關(guān)；T組原核微生物群落只與水分含量呈正相關(guān)；而F組和S組則與鹽度呈正相關(guān)。此外，乳桿菌屬（Lactobacillus）與水分含量呈正相關(guān)；弧菌屬（Vibrio）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和乳球菌屬（Lacto coccus）與水分含量、pH值、過(guò)氧化值呈正相關(guān)；鹽單胞菌屬（Halomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、鹽弧菌屬（Salinivibrio）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）與鹽度呈正相關(guān)。利用條件限制分析探究每個(gè)理化因子對(duì)原核微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度，其中鹽度（30.29%）對(duì)菌群的影響最大，其次為pH（26.08%），進(jìn)一步說(shuō)明多個(gè)理化因子共同決定不同鹽度香腸原核微生物群落的變化。

圖5 香腸樣品的原核微生物群落和理化因子冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of prokaryotic microbial communities and physicochemical factors of sausage samples

3 結(jié)論

本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)揭示鹽濃度對(duì)自制香腸原核微生物群落多樣性的影響，同時(shí)分析鹽濃度對(duì)自制香腸理化因子的影響。鹽可以顯著影響pH、水分含量及過(guò)氧化值，并且也會(huì)顯著影響原核微生物的多樣性和組成。隨著鹽濃度的不斷增加，OTU、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，厚壁菌門(mén)的平均相對(duì)豐度隨香腸中鹽濃度升高而增加，而變形菌門(mén)則呈相反的變化趨勢(shì)。在屬水平上，乳桿菌屬是香腸原核微生物的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度在30.29%～58.15%范圍之間。明串珠菌屬、弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬、鹽單胞菌屬、片球菌屬、鹽弧菌屬和四聯(lián)球菌屬受鹽添加量的影響顯著。此外，冗余分析結(jié)果表明原核微生物群落結(jié)構(gòu)與鹽度呈正相關(guān)，且鹽度對(duì)菌群的影響最大。綜上所述，添加4%食鹽的香腸具有更高的乳酸菌豐度。本研究有助于了解加鹽對(duì)香腸發(fā)酵微生態(tài)的影響，為香腸的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。