動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002發(fā)酵條件優(yōu)化

余 萍，張春宇，矯艷平*，徐長(zhǎng)隆，呂雪鑫，趙 迪，閔祥博

（漢臣氏（沈陽(yáng)）兒童制品有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

益生乳酸菌是對(duì)人體健康有益的活性微生物，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，合成多種維生素（如維生素B1、維生素B2、維生素B6、葉酸、煙酸、維生素B12等）供人體所需，促進(jìn)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化與吸收，促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣、鐵、維生素D的吸收等[1]。雙歧桿菌（Bifidobacterium）是由法國(guó)巴斯德研究院的TISSIER于1899年首先在母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)的專性厭氧菌，是健康動(dòng)物腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌種，其數(shù)量隨年齡而變化，且與機(jī)體內(nèi)許多生理病理變化關(guān)系密切[2]。雙歧桿菌被認(rèn)為是人類和其他溫血?jiǎng)游锬c道中的關(guān)鍵微生物屬[3-4]。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種即乳雙歧桿菌[5-7]，是腸道中最典型的有益菌，具有促進(jìn)腸道健康[8-9]、提高免疫力[10-12]、抑制有害菌生長(zhǎng)[13]、預(yù)防腸道有關(guān)疾病[14]等多種生理功能，可以作為發(fā)酵劑或原料應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如微生態(tài)制劑、雙歧桿菌果汁飲料、乳制品、保健食品及其他益生菌產(chǎn)品中。

動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002具有優(yōu)良的耐逆環(huán)境能力及緩解乳糖不耐受、降甘油三酯等益生特性，但具有較好的存活能力和較高的活菌數(shù)是益生菌發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，適合的培養(yǎng)條件是其實(shí)現(xiàn)高活菌數(shù)培養(yǎng)的關(guān)鍵。培養(yǎng)基作為菌體所處的直接環(huán)境，不但為菌體生長(zhǎng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還會(huì)參與到菌體細(xì)胞內(nèi)的多種代謝過(guò)程，因此培養(yǎng)基成分必須具有細(xì)胞膜通透性，同時(shí)可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量，并提供碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素和水等基礎(chǔ)生長(zhǎng)元素[15]。陳夷平[16]通過(guò)對(duì)羅伊氏乳桿菌IMAU10281的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，獲得了108CFU/mL的菌體密度，是優(yōu)化前的6.81倍。陳百瑩等[17]對(duì)植物乳桿菌ZJ316的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，菌體密度達(dá)到了9.28×109CFU/mL。

本研究以動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002為研究對(duì)象，以菌泥收率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵工藝；以活菌數(shù)為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其培養(yǎng)基組成，為實(shí)現(xiàn)其凍干菌粉的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及其在益生菌發(fā)酵產(chǎn)品中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002：篩選自2月齡健康順產(chǎn)男嬰糞便，保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.19509。

1.1.2 化學(xué)試劑

FP103酵母蛋白胨、FM902酵母浸出物：安琪酵母股份有限公司；無(wú)水葡萄糖：食藥集團(tuán)圣雪葡萄糖有限責(zé)任公司；無(wú)水乙酸鈉、磷酸二氫鉀、一水硫酸錳、七水硫酸鎂：江蘇科倫多食品配料有限公司；吐溫80：江蘇四新界面劑科技有限公司；Hilmar5000乳糖：天津銀河偉業(yè)進(jìn)出口有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS改良培養(yǎng)基：酵母蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉10.0g/L，酵母浸出物10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-360/420電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；721型可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-10CA生物顯微鏡：上海佑科儀器儀表有限公司；DZKWS-8電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16M低溫高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LAI-3DT厭氧工作站：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種保存

挑取動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002單菌落，接種于5 mL MRS改良培養(yǎng)基中，39 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，以5%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接于200 mL MRS改良培養(yǎng)基中，39 ℃靜置培養(yǎng)16 h，將200 mL菌懸液離心（12 000 r/min、10 min）后取菌泥，加入8 mL MRS改良培養(yǎng)基和12 mL 50%甘油，分裝于凍存管中（1 mL/支），-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 菌種種子液制備

將動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002菌種凍存管放入37 ℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇15～30 s，將凍存管內(nèi)菌種1 mL接種至10 mL MRS改良培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)17 h，獲得種子液。

1.3.3 菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液初始pH值和接種量是影響乳酸菌高活菌數(shù)培養(yǎng)的重要因素[18-20]，因此試驗(yàn)選擇這3個(gè)因素對(duì)菌株HCS04-002的發(fā)酵工藝優(yōu)化。取種子液以一定的接種量轉(zhuǎn)接到80 mL MRS改良培養(yǎng)基中，一定溫度下靜置培養(yǎng)17 h后，測(cè)定發(fā)酵液的pH和菌泥收率，分別單獨(dú)考察發(fā)酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）和初始pH值（6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）對(duì)菌泥收率的影響，其計(jì)算公式如下：

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、初始pH值和接種量為影響因素，以發(fā)酵液菌泥收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

將冷凍菌種復(fù)蘇后，接種至MRS改良培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)活化后轉(zhuǎn)接到300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基中固定成分添加量為低聚果糖5 g/L，L-蘋果酸5 g/L，檸檬酸2 g/L，氯化鈣0.5 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，考察不同添加量的酵母蛋白胨（0、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L）、酵母浸出物（10 g/L、20 g/L、30g/L、40g/L、50g/L）、葡萄糖（0、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L）、乳糖（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）對(duì)菌株發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。按照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》中的方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇酵母蛋白胨（A）、酵母浸出物（B）、葡萄糖（C）、乳糖（D）添加量為考察因素，以菌懸液活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation medium optimization

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和可靠性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

發(fā)酵溫度、接種量及初始pH值對(duì)菌懸液菌泥收率的影響見圖1。由圖1a可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在33～39 ℃時(shí)，隨著溫度的升高菌泥收率逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時(shí)，菌泥收率達(dá)到最高，為0.847%；當(dāng)發(fā)酵溫度高于39 ℃之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳發(fā)酵溫度為39 ℃。由圖1b可知，當(dāng)接種量在1%～3%時(shí)，菌泥收率隨之逐漸升高；當(dāng)接種量為3%時(shí)，菌泥收率達(dá)到最高，為0.820%；當(dāng)接種量＞3%之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳接種量為3%。由圖1c可知，當(dāng)初始pH值在6.8～7.2時(shí)，菌泥收率隨之逐漸升高；當(dāng)初始pH值為7.2時(shí)，菌泥收率達(dá)到最高，為0.828%；當(dāng)初始pH值＞7.2之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳初始pH值為7.2。

圖1 發(fā)酵溫度（a），接種量（b）及初始pH值（c）對(duì)發(fā)酵液菌泥收率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature (a),inoculum (b) and initial pH value (c) on bacterial sludge yield of fermentation broth

2.1.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、初始pH值（C）為自變量，以菌泥收率為考察指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation technology optimization

由表3可知，根據(jù)R值可知，影響菌泥收率的因素順序?yàn)锳＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞初始pH值＞接種量。由k值可知，最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A3B2C2，即發(fā)酵溫度39 ℃，接種量3%，初始pH值7.2。按此培養(yǎng)條件對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，重復(fù)試驗(yàn)3次，菌泥收率平均值達(dá)1.07%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

考察酵母蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、乳糖添加量4個(gè)因素對(duì)活菌數(shù)的影響，考察其中1個(gè)因素時(shí)其他3個(gè)因素的水平固定為水平中間值，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，酵母蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、乳糖4個(gè)因素對(duì)活菌數(shù)的影響均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酵母蛋白胨添加量為20 g/L時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為2.0×109CFU/mL；當(dāng)酵母蛋白胨添加量＞20 g/L，發(fā)酵液活菌數(shù)下降。因此，最佳酵母蛋白胨添加量為20 g/L。當(dāng)酵母浸出物添加量為20 g/L時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到最高，為2.1×109CFU/mL；隨著酵母浸出物添加量的繼續(xù)增加，發(fā)酵液活菌數(shù)下降。因此，最佳酵母浸出物添加量為20 g/L。當(dāng)葡萄糖添加量為10 g/L時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到最高，為2.2×109CFU/mL。因此，最佳葡萄糖添加量為10 g/L。乳糖添加量＜10 g/L時(shí)，活菌數(shù)隨乳糖添加量的增加而升高；當(dāng)乳糖添加10 g/L時(shí)活菌數(shù)最高，為2.2×109CFU/mL；當(dāng)乳糖添加量＞10 g/L時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)反而下降。因此，最佳乳糖添加量為10 g/L。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor tests for fermentation medium optimization

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，依據(jù)Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇酵母蛋白胨（A）、酵母浸出物（B）、葡萄糖（C）、乳糖（D）添加量為考察因素，以菌懸液活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation medium optimization

續(xù)表

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程Y=2.68+0.25A-0.042B-0.067C+0.075D+0.100AB+0.000AC+0.20AD+0.28BC+0.050BD-0.075CD-0.33A2-0.24B2-0.56C2-0.59D2

由表5可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），說(shuō)明該模型對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002發(fā)酵培養(yǎng)的活菌數(shù)的分析和預(yù)測(cè)較精準(zhǔn)，失擬項(xiàng)（P=0.593 4＞0.05），無(wú)顯著性差異。模型決定系數(shù)R2=0.788 5，校正決定系數(shù)R2Adj=0.577 0，說(shuō)明該模型方程擬合度良好，可以較好的反應(yīng)各因素之間的關(guān)系[21]。各因素的F值可評(píng)價(jià)該因素對(duì)響應(yīng)值的影響，F(xiàn)值越大，表明該因素的影響越顯著[22-23]。因此，對(duì)活菌數(shù)的影響順序依次是酵母蛋白胨＞乳糖＞葡萄糖＞酵母浸出物。一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2對(duì)活菌數(shù)有顯著影響（P＜0.05），二次項(xiàng)C2和D2對(duì)活菌數(shù)有極顯著影響（P＜0.01）。

響應(yīng)面曲面的坡度反映該因素對(duì)活菌數(shù)影響的強(qiáng)弱程度[24，25]，等高線橢圓形表明變量間交互作用顯著，圓形則表明變量間交互作用不顯著[26]。各因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線結(jié)果見圖3。由圖3可知，相應(yīng)曲面圖形的開口均向下，說(shuō)明響應(yīng)面范圍覆蓋了最大值所在的區(qū)域。等高線圖均呈規(guī)則的橢圓形，四個(gè)因素兩兩之間交互作用均顯著。

圖3 各因素交互作用對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002活菌數(shù)的影響的響應(yīng)面及等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of various factors on the viable bacterial count of Bifidobacterium animalis subsp. lactis HCS04-002

模型預(yù)測(cè)最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母蛋白胨24.13 g/L、酵母浸出物29.70 g/L、葡萄糖19.23 g/L、乳糖10.68 g/L，在此條件下，活菌數(shù)理論值為2.74×109CFU/mL。為了方便實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方修正為：酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，活菌數(shù)實(shí)際值為2.73×109CFU/mL，與理論值接近，說(shuō)明該模型能準(zhǔn)確反映各因素添加量的變化與活菌數(shù)之間的關(guān)系，該模型具有可靠性。

3 結(jié)論

本研究對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，首先以菌泥收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002發(fā)酵工藝為：培養(yǎng)溫度39 ℃，接種量3%，初始pH值7.2。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液的活菌數(shù)達(dá)2.73×109CFU/mL，是MRS改良培養(yǎng)基及37 ℃培養(yǎng)活菌數(shù)（8.82×108CFU/mL）的3.10倍，達(dá)到增菌培養(yǎng)的目的。