提高前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的氟化PEI 基因載體研究

郭世英

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine, PEI）是一類陽離子聚合物，能夠幫助目的基因?qū)崿F(xiàn)內(nèi)體逃逸，提高轉(zhuǎn)染效率。然而，PEI 也具有較大的細(xì)胞毒性。研究表明PEI 通過修飾后可提高其基因轉(zhuǎn)染效果并降低對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性[1]。

氟元素電負(fù)性大，氟修飾的化合物常具有疏水疏油的性質(zhì)[2]，本研究使用五氟丙酸酐對(duì)PEI 進(jìn)行修飾，以提高其與細(xì)胞膜的親和力，增加轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，氟修飾可降低PEI 的細(xì)胞毒性，改善細(xì)胞攝取、內(nèi)體逃逸和細(xì)胞內(nèi)DNA 釋放過程。此外，由于氟化聚合物低表面能，在低濃度時(shí)傾向于相互結(jié)合，因此氟修飾后的PEI（PEIF）在較低氮磷比時(shí)便能與核酸形成復(fù)合物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

PEI（MW:1.8kDa ），五氟丙酸酐，pCMV-GFP 質(zhì)粒，PC3 細(xì)胞系，Brookhaven PALS/90P Zeta PALS 電位粒度分析儀、凝膠電泳裝置，熒光顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PEIF 的制備及表征

將1 mmol PEI 和3.6 mmol 三乙胺溶解于20mL 無水甲醇中，后緩慢滴加到含3 mmol 五氟丙酸酐的10 mL 無水甲醇中，室溫下攪拌72 h 后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用去離子水復(fù)溶后裝入500 Da 的透析袋中透析48 h，之后凍干得到PEIF。用核磁共振氟譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.2 PEI/pCMV-GFP、PEIF/pCMV-GFP 復(fù)合物的制備及表征

將5μg 質(zhì)粒溶于1.8 mL 超純水中，加入200μL 的PEI 溶液（1mg/mL），混勻后室溫靜置30min 得到PEIF/pCMV-GFP 復(fù)合體。室溫下測(cè)定復(fù)合物的粒徑和電位。PEIF/pCMV-GFP 復(fù)合物通過相同的方法制備。

1.2.3 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

將1μg質(zhì)粒與不同濃度PEIF 溶液混勻，室溫孵育30min。以質(zhì)粒DNA為對(duì)照，點(diǎn)樣到1.0%的瓊脂糖凝膠中，120V下電泳30min 后采集圖像。

1.2.4 PEI、PEIF 轉(zhuǎn)染PC3 細(xì)胞

PC3 細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)吸去舊培養(yǎng)基，加入150μL 無血清培養(yǎng)基和50μL 的DNA/PEI復(fù)合物。DNA/PEI 復(fù)合物制備過程：將1μg 質(zhì)粒加入無血清培養(yǎng)基中，再加入PEI，室溫孵育30min 后，將DNA/PEI 復(fù)合物加入細(xì)胞孔板中，輕輕混勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEIF 的構(gòu)建與表征結(jié)果

用五氟丙酸酐與1.8 kDa PEI 反應(yīng)合成PEIF。PEI 與氟代丙酸酐的質(zhì)量比為1:6、1:3、1:1.5，產(chǎn)物表示為PEIF（1:6）、PEIF（1:3）、PEIF（1:1.5）。圖2 所示，通過PEI 與五氟丙酸酐的反應(yīng)合成了含酰胺鍵的PEIF，酰胺鍵的出現(xiàn)表明PEIF 復(fù)合物的成功構(gòu)建。

圖1 PEIF 載體構(gòu)建

圖2 PEIF 的核磁共振氟譜圖

2.2 pCMV-GFP/PEI、pCMV-GFP/PEIF 復(fù)合物構(gòu)建及表征

的結(jié)果分析

對(duì)復(fù)合物粒徑和電位進(jìn)行表征，并得到了相應(yīng)的結(jié)果（表1）。復(fù)合物在最佳質(zhì)量比例下帶正電荷，所有PEIF 都能將DNA濃縮成100nm 以內(nèi)的納米粒子。

表1 不同質(zhì)量比的DNA/PEIF 粒徑、電位、分散系數(shù)

2.3 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

利用凝膠電泳研究了PEIF 的DNA 濃縮能力。圖3 所示，PEIF 具有較好的DNA 結(jié)合能力，在相對(duì)較低的質(zhì)量比下有效阻礙DNA 遷移。結(jié)果顯示，pCMV-GFP/PEI 的質(zhì)量比為4:1 時(shí)完全阻滯；DNA/PEIF（1:6）質(zhì)量比在1:2 時(shí)完全阻滯；DNA/PEIF（1:3）質(zhì)量比在4:1 時(shí)完全阻滯；DNA/PEIF（1:1.5）質(zhì)量比在8:1 時(shí)完全阻滯。

圖3 凝膠阻滯結(jié)果

2.4 PEI、PEIF 的DNA 轉(zhuǎn)染效率

利用GFP 為報(bào)告基因，在PC3 細(xì)胞中檢測(cè)PEI 和PEIF 的DNA 轉(zhuǎn) 染 效 果，Lipo 3000 為 對(duì)照。圖4 為不同質(zhì)量比PEIF 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GFP 的表達(dá)情況。與Lipo3000 相比，PEI、PEIF 的細(xì)胞毒性顯著低于Lipo3000。單純PEI 表現(xiàn)出極低的GFP 轉(zhuǎn)染效果，而PEIF 轉(zhuǎn)染效果顯著提高，說明氟修飾可顯著增強(qiáng)PEI 轉(zhuǎn)染效率。此外，PEIF 以較低的質(zhì)量比率獲得最佳的轉(zhuǎn)染。PEIF（1:6）、PEIF（1:3）、PEIF（1:1.5）的轉(zhuǎn)染效率依次增加；DNA/PEIF（1:6）質(zhì)量比在1:8、1:10 開始有轉(zhuǎn)染效果；質(zhì)量比1:14、1:16、1:18、1:20 的DNA/PEIF（1:3）轉(zhuǎn)染效率較高；質(zhì)量比1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20 的DNA/PEIF（1:1.5）轉(zhuǎn)染效率較高。在所有PEIF 中，PEIF（1:1.5）轉(zhuǎn)染PC3 細(xì)胞的效率最高，這是由于PEI 表面接枝過量的氟鏈會(huì)降低樹枝狀分子的表面電荷密度，從而阻止穩(wěn)定聚合物/DNA 復(fù)合物的形成。轉(zhuǎn)染48h 的結(jié)果顯示，PEIF（1:1.5）與質(zhì)粒的質(zhì)量比為1:20 時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率高于Lipo3000。

圖4 PEI、PEIF 轉(zhuǎn)染PC3 細(xì)胞48h

3 結(jié)論

PEI 經(jīng)氟修飾后形成的PEIF 轉(zhuǎn)染效率顯著增加，氟修飾的PEIF 能夠降低細(xì)胞毒性，保持較高的轉(zhuǎn)染效率。本研究設(shè)計(jì)了不同的氟修飾比例以及質(zhì)粒DNA 與氟化PEI 的質(zhì)量比，通過凝膠阻滯和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)探究最適轉(zhuǎn)染效率對(duì)應(yīng)的比例，篩選獲得比轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000 毒性更低且轉(zhuǎn)染效率更高的PEIF，研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量比為1：20 的氟化PEI（1:1.5）可實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒載體在PC-3 細(xì)胞中的高效表達(dá)，這為改良高效的質(zhì)粒遞送轉(zhuǎn)染試劑提供了新思路。