鐵皮石斛品質(zhì)影響因素快速無損檢測及光譜特性分析

陳豐農(nóng)， 桑佳茂， 姚 睿， 孫宏偉， 張 垚， 張競成， 黃 赟， 徐俊鋒

1. 杭州電子科技大學(xué)自動化學(xué)院， 浙江 杭州 310018 2. 金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 金華 321017 3. 杭州師范大學(xué)遙感與地球?qū)W院， 浙江 杭州 311121

引 言

隨著人民生活水平的提高， 中草藥等天然藥物的醫(yī)療和保健作用日益受到重視。 中藥質(zhì)量是中藥產(chǎn)業(yè)的生命線， 臨床療效是中草藥品質(zhì)評價的最主要目的， 中藥的療效確切和質(zhì)量穩(wěn)定， 是醫(yī)生辯別藥效準(zhǔn)確的保障， 否則出現(xiàn)“病準(zhǔn)方對藥不靈”的情況[1]。 鐵皮石斛作為重要的中藥材， 其品質(zhì)好壞對療效影響較大， 因此對其品質(zhì)影響因素進(jìn)行定量分析有重要意義。

目前中草藥的品質(zhì)鑒定方法主要包括： (1)化學(xué)檢驗法[2]。 該方法得到的結(jié)果較為準(zhǔn)確， 但繁瑣且有損。 隨著中草藥需求量的增大， 化學(xué)檢驗漸漸不能滿足品質(zhì)檢測的要求。 (2)經(jīng)驗判別法[3]。 從李時珍編寫本草綱目時就使用該方法。 例如根據(jù)植物的外觀、 藥材的形態(tài)和生境描述判斷中藥品質(zhì)。 但現(xiàn)代環(huán)境的劇烈變化已經(jīng)制約了“看產(chǎn)地確定品質(zhì)”。 (3)DNA測序法[4]。 直接在基因序列層面， 采用DNA測序進(jìn)行中草藥檢測。 該方法非常精準(zhǔn)， 但不能同時兼顧快速和無損兩個要求。 (4)光譜檢測法。 用光譜的吸收特性來判別某種影響品質(zhì)的關(guān)鍵因素， 以此來判斷中草藥的品質(zhì)好壞。 通過光譜系統(tǒng)搭建， 建立檢測模型， 實現(xiàn)中草藥品質(zhì)的快速與無損檢測。 但需對光譜特征進(jìn)行精準(zhǔn)篩選， 否則會影響反演方法的有效性。

根據(jù)文獻(xiàn)， 可知葉綠素含量、 糖度和pH值對鐵皮石斛品質(zhì)有重要影響。 針對三種不同地域(浙江、 安徽和云南)的鐵皮石斛， 先用化學(xué)方法測量葉綠素含量、 糖度和pH值作為對照組， 再通過特征光譜建立與各品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性。 嘗試以此三種因素作為新的檢測指標(biāo)。

1 實驗部分

1.1 品質(zhì)參數(shù)選取

依據(jù)《中華人民共和國藥典》[5]， 鐵皮石斛以多糖和甘露糖為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 唐麗[6]認(rèn)為鐵皮石斛中的多糖、 石斛堿和黃酮是其主要藥效成分， 其含量與鐵皮石斛的品質(zhì)直接相關(guān)， 不同地域、 不同生長齡乃至同一地域不同種植者種出的產(chǎn)品的主要成份差別很大。 多糖成分與鐵皮石斛的藥效， 如增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能、 抗腫瘤、 抗衰老、 抗疲勞、 降血糖等方面有著密切聯(lián)系。 王麗霞[7]對鐵皮石斛的多糖提取和抗氧化活性研究。 石斛堿的藥理作用主要表現(xiàn)對心血管、 胃腸道作用及退熱止痛等。 葛穎華[8]測定了鐵皮石斛中石斛堿、 多糖的含量。 于萌萌[9]為了揭示鐵皮石斛內(nèi)生菌與功效成分的關(guān)系， 測定21種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌絲及發(fā)酵液提取物中糖類和黃酮類成分， 并判斷了菌種中是否含有糖類和黃酮成分。

本研究把糖度和pH值作為多糖和石斛堿的替代因素， 與此同時由于葉綠素的養(yǎng)生保健特性， 把葉綠素也作為鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標(biāo)。

葉綠素(chlorophyll)： 是各種高等植物進(jìn)行光合作用的一種綠色色素[10]。 葉綠素從光中吸收能量， 然后將二氧化碳轉(zhuǎn)換為碳水化合物能量。 葉綠素有很強(qiáng)的養(yǎng)生保健作用， 世界醫(yī)學(xué)權(quán)威證實葉綠素可以強(qiáng)化免疫功能， 促進(jìn)新陳代謝[11]。 葉綠素可以為人類的身體健康增強(qiáng)造血作用， 提供維生素， 抗病， 解毒等作用。 因此， 用葉綠素含量作為鐵皮石斛品質(zhì)檢測的指標(biāo)之一。

糖度： 鐵皮石斛的多糖含量是衡量其品質(zhì)優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)， 這在多個文獻(xiàn)中得到了證實[12]。 同時， 也有文獻(xiàn)提到鐵皮石斛的糖度與藥用性的關(guān)系[13]。 由于莖是人們食用鐵皮石斛的部位， 因此針對不同種類鐵皮石斛的莖進(jìn)行糖度測量。

pH值： 鐵皮石斛中石斛堿的含量也是衡量鐵皮石斛品質(zhì)的一個重要指標(biāo)[14]。 石斛堿是一種生物堿， 和酸反應(yīng)生成鹽。 因此可用pH值對石斛堿進(jìn)行度量。

1.2 儀器

選用ASD(Analytical Spectral Device)公司的 FieldSpect4光譜儀采集鐵皮石斛的光譜數(shù)據(jù)， 檢測范圍350～2 500 nm； 分光光度計采用島津UV3600plus， 該儀器在高分辨率(最大分辨率: 0.1 nm)的同時仍能保持超低雜散光水平(340 nm處為0.000 05%)。 185～3 300 nm的寬波長量程覆蓋紫外、 可見及紅外光區(qū)。 用于測量鐵皮石斛葉綠素含量中所需要的吸光度值； 采用愛宕PAL-1迷你數(shù)顯糖度-酸度一體機(jī)檢測糖度。

1.3 方法

化學(xué)實驗需要提取不同鐵皮石斛的光譜數(shù)據(jù)和理化參數(shù)， 然后進(jìn)行品質(zhì)含量反演， 建立相關(guān)模型， 再對模型的有效性進(jìn)行分析。 本研究中涉及到的實驗流程如下：

(1)選取實驗樣本。 涉及不同地域的鐵皮石斛。 市面上最為著名的為安徽霍山鐵皮石斛， 浙江雁蕩山鐵皮石斛。 除了以上兩種， 本研究又選用了一種在我國西南邊陲的云南鐵皮石斛， 樣本量共60株， 為了得到足夠的光譜， 每株選擇多個光譜采集點。

(2)數(shù)據(jù)預(yù)處理。 將三種不同地域的鐵皮石斛各取等量， 去除石斛的葉、 根和花， 剩下待研究的莖。 在預(yù)處理過程中， 同時將樣本編號， 便于之后的數(shù)據(jù)記錄和整理。

(3)采集光譜數(shù)據(jù)。 采集光譜時曝光時間為136 ms。 為了減少采集數(shù)據(jù)環(huán)境因素的影響， 每一個樣本采集10次， 取10次的均值為為最終光譜數(shù)據(jù)。

(4)試樣制備。 每個樣本選取0.5 g剪碎。 將預(yù)處理的樣本放入15 mL離心管中， 加入5 mL甲醇溶液并密封， 為了避光用錫箔紙包裝處理。 將樣本溶液在室溫下靜置5 h以上備用。

(5)獲取樣本的葉綠素含量。 通過分光光度法測量樣本中的葉綠素含量[15]。 前一步的備用溶液為待測樣本溶液。 提取液(甲醇溶液)為空白溶液， 調(diào)零點， 池空白處理[16]。 之后換樣本溶液， 分別測量在470， 653和666 nm處的吸光度值。 計算上述470 nm(A470)， 653 nm(A653)和666 nm(A666)處的吸光度值[17]， 計算方法如式(1)所示

ca=15.65A666-7.34A653

cb=27.05A653-2.86A666

(1)

ca+b=1 000A470-2.86ca-129.2cb

式(1)中：ca和cb分別為葉綠素a、 b的濃度， 單位為mg·L-1；ca+b為總?cè)~綠素濃度， 單位為mg·L-1。

運用式(1)得出各個樣本的葉綠素含量， 按照標(biāo)號記錄數(shù)據(jù)。

(6)獲取糖度值。 取第四步得到的試樣溶液， 使用糖度計測量溶液的糖度。 每個樣本分別選取離心試管中的上層， 中層， 下層溶液檢測糖度， 記為S1， S2和S3(%)， 取均值作為溶液的糖度。

(7)獲取各個樣本的pH值。 取第四步得到的試樣溶液， 使用pH計測量溶液的pH值， 每個樣本分別取三次P1， P2和 P3， 最終pH值取三次結(jié)果的均值。

將以上實驗獲取的葉綠素含量、 糖度和pH值按照不同種類不同編號錄入數(shù)據(jù)。

將光譜數(shù)據(jù)得到的能量系數(shù)(包括波段與尺度)， 與理化參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析， 得到?jīng)Q定系數(shù)， 選取決定系數(shù)中較高的能量系數(shù)作為小波特征。 根據(jù)得到的小波特征， 運用最小化二乘法擬合數(shù)據(jù)， 并且對模型進(jìn)行有效性分析。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對多次采集的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化處理， 將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行小波變換， 得到小波能量系數(shù)與每一個理化參數(shù)的相關(guān)性， 小波能量系數(shù)包括波段(400～2 500 nm)和尺度(0～10， 共11個尺度)。 選取相關(guān)性系數(shù)中前3%的小波作為理化參數(shù)對應(yīng)的特征小波， 用于建立品質(zhì)影響因素模型。

將上述小波變換得到的特征小波作為最小二乘法的自變量， 理化參數(shù)作為模型的因變量。 將實驗中的數(shù)據(jù)作為測試集進(jìn)行最小二乘法處理， 得到因變量的系數(shù)， 即品質(zhì)影響因素模型， 計算模型的相關(guān)系數(shù)以及均方根誤差進(jìn)有效性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鐵皮石斛光譜圖

實驗發(fā)現(xiàn)三種鐵皮石斛的光譜形狀具有一致的光譜特征屬性， 在930 nm附近有最大波峰， 1 000 nm附近有最小波谷， 1 100 nm附近有最小波峰； 1 290與1 740 nm附近有較大波峰， 1 480與1 940 nm附近有較小波谷； 680 nm附近有最小波谷， 600 nm附近有最小波峰。 說明鐵皮石斛不同品種所表現(xiàn)出來的主要理化特征有較好的一致性。

2.2 葉綠素含量光譜分析及品質(zhì)反演

對于鐵皮石斛葉綠素含量反演模型的有效性分析。 其中， 浙江雁蕩山鐵皮石斛的決定系數(shù)(R2)為0.819， 均方根誤差(RMSE)為0.035。 安徽霍山鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.820， 均方根誤差(RMSE)為0.013。 云南鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.865， 均方根誤差(RMSE)為0.017。 圖1是3種不同鐵皮石斛葉綠素含量反演結(jié)果的散點圖。

圖1 浙江雁蕩山(a)， 安徽霍山(b)， 云南地區(qū)(c)鐵皮石斛葉綠素含量反演結(jié)果

鐵皮石斛葉綠素含量反演模型的校正集有效性分析， 相關(guān)系數(shù)r為0.92。

2.3 糖度光譜分析及品質(zhì)反演

鐵皮石斛中的糖度是品質(zhì)評定的重要指標(biāo)。 以下是三種鐵皮石斛糖度品質(zhì)模型散點圖。 對這三種鐵皮石斛的糖度含量反演模型進(jìn)行有效性分析， 浙江雁蕩山鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.756， 均方根誤差(RMSE)為0.025。 安徽霍山鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.840， 均方根誤差(RMSE)為0.032。 云南鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.847， 均方根誤差(RMSE)為0.091 6。

圖2 浙江雁蕩山(a)， 安徽霍山(b)， 云南地區(qū)(c)鐵皮石斛的糖度含量反演模型有效性分析

鐵皮石斛糖度反演模型校正集的有效性分析， 相關(guān)系數(shù)r為0.87。

2.4 pH值光譜分析及品質(zhì)反演

pH值可以間接度量石斛堿的含量， 是衡量鐵皮石斛品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。 pH值反演模型有效性分析， 浙江雁蕩山鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.819， 均方根誤差(RMSE)為0.034 5。 安徽霍山鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.875， 均方根誤差(RMSE)為0.047。 云南鐵皮石斛決定系數(shù)(R2)為0.892， 均方根誤差(RMSE)為0.094。

圖3 浙江雁蕩山(a)， 安徽霍山(b)， 云南地區(qū)(c)鐵皮石斛pH值模型反演及散點圖

鐵皮石斛pH值反演模型校正集的有效性分析， 相關(guān)系數(shù)r為0.85。

2.5 結(jié)果誤差分析

影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的有以下原因：

(1) 光線、 環(huán)境對鐵皮石斛光譜數(shù)據(jù)采集有一定的影響， 以后考慮用輻照度計進(jìn)行矯正。

(2) 鐵皮石斛的生長程度和雜質(zhì)會影響理化參數(shù)測量。

(3) 用分光光度法測量葉綠素含量時濕度會影響測量結(jié)果。

(4) 測量儀器本身的誤差和測量方式也會影響測量結(jié)果。

3 結(jié) 論

通過測量葉綠素含量、 糖度和pH值作為衡量鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標(biāo)。 通過光譜分析和對照組的對比發(fā)現(xiàn)， 這三種指標(biāo)與鐵皮石斛品質(zhì)的相關(guān)性均大于0.8， 均方根誤差也都小于0.1， 可以作為品質(zhì)參數(shù)模型的衡量指標(biāo)； 但是僅僅憑借這三個指標(biāo)對鐵皮石斛的性質(zhì)和品質(zhì)進(jìn)行評價還是有欠缺的， 需要后續(xù)結(jié)合其他方法和指標(biāo)進(jìn)一步探究。

通過該研究可知， 葉綠素含量、 糖度和pH值作為衡量鐵皮石斛品質(zhì)的指標(biāo)， 與光譜特性有極高的相關(guān)性。 同時也為其他中草藥等天然藥物快速無損檢測提供一定的思路。