FTIR光譜快速鑒別刺梨黃酮的研究

周 靜， 張青青， 蔣勁國， 聶 倩， 白忠臣*

1. 貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025 2. 貴州大學(xué)貴州省光電子技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025

引 言

刺梨黃酮是一類生物活性很高的小分子化合物， 在植物中廣泛存在。 刺梨鮮果中總黃酮含量平均為6.80 mg·g-1， 最高達(dá)8.00 mg·g-1， 其含有的兒茶素、 槲皮素、 山奈酚等類黃酮， 對人體健康有益[1]。 已有文獻(xiàn)報(bào)道對刺梨黃酮的體外抗氧化活性的研究， 發(fā)現(xiàn)刺梨黃酮能清除各種活性氧， 并能顯著抑制紅細(xì)胞氧化溶血細(xì)胞、 肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成[2]， 除此以外刺梨果實(shí)被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化、 抗誘變、 抗動脈粥樣硬化、 抗腫瘤和防輻射活性[3]。 Xu等研究了刺梨類黃酮在抗細(xì)胞凋亡性中的作用， 并且證實(shí)了其具有防輻射作用[4]。 目前已有許多關(guān)于刺梨多糖、 超氧化物歧化酶、 刺梨黃酮等活性化合物質(zhì)的研究[5-7]， 但直接檢測刺梨果肉中黃酮的傅里葉紅外光譜少有報(bào)道。

由于超聲波提取法具有無需專用設(shè)備、 操作簡單、 節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。 超聲結(jié)合酶輔助半仿生提取法具有提取率高， 準(zhǔn)確度好， 快速等優(yōu)點(diǎn)， 可有效提取植物果實(shí)中的黃酮分子。 從而這兩種方法可適用于刺梨黃酮的提取[8]。 Liu等[9]采用超聲輔助半仿生法， 提取了粟米黃酮， 并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究， 結(jié)果表明超聲半仿生技術(shù)可作為一種簡便、 經(jīng)濟(jì)的提取粟米草總黃酮的方法。

對刺梨黃酮的鑒別， 傳統(tǒng)測定的方法有液相色譜法， 紫外可見光譜分析以及化學(xué)顯色法， 不僅速度慢、 成本高， 且不適合大批樣本測定[10]。 如液相色譜法需要配備的儀器昂貴， 實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間較長， 難以實(shí)現(xiàn)刺梨黃酮的快速測定[11]。 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer， FTIR)是一種基于樣品化學(xué)鍵， 分子振動信息的有機(jī)物快速分析技術(shù)， 具有靈敏度高， 重復(fù)性好， 掃描速度快， 低成本等特點(diǎn)， 已在醫(yī)學(xué)， 食品及工業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[12]。 Kumar等[13]通過FTIR方法分析了決明子中黃酮類化合物的指紋紅外光譜， 準(zhǔn)確地鑒定出了該植物總?cè)旱念悇e。

本文采用FTIR分析了刺梨黃酮的紅外光譜特性， 快速鑒別刺梨黃酮， 為開發(fā)刺梨新功能性食品提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

新鮮野生刺梨果(購買于六盤水盤州食品有限公司)； HCl(≥98%)， 胃蛋白酶(1∶3 000)， 胰酶(USP級)， 無水膽酸(98%)， NaHCO3溶液(3.7%)， NaCl(GR， 99.8%)均購買于阿拉丁化學(xué)試劑有限公司， 用于酶輔助半仿生提取法中模擬胃腸消化環(huán)境； 無水乙醇(分析純， 購買于天津市富宇精細(xì)化工有限公司)作為超聲溶劑萃取法的萃取劑。

1.2 儀器

高精度電子天平(JM-BL1003, 余姚市紀(jì)銘稱重設(shè)備有限公司)， 85-2A雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(金壇市城東新瑞儀器廠)， 超聲清洗器(ps-30A， 深圳市深華泰設(shè)備有限公司)， 傅里葉變換紅外光譜儀(V70， 德國布魯克光譜儀器公司)， 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3 方法

樣品1： 取一新鮮刺梨果， 洗凈， 剔刺， 切成透明薄片(厚度約0.5 mm)置于載玻片上待測； 樣品2： 取一室溫條件下存放48h后的刺梨果， 剃刺切成薄片(厚度約0.5 mm)置于載玻片上待測， 用于與新鮮刺梨果的FTIR對比。

超聲輔助溶劑萃取法： 設(shè)置三個實(shí)驗(yàn)組， 第一組稱取40.6 g新鮮野生刺梨果果肉研磨成勻漿后移至燒杯中， 加入150 mL無水乙醇； 第二組稱取40.6 g新鮮果肉， 使用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE)， 設(shè)置溫度150 ℃殺青10 min， 然后45 ℃烘干24 h獲得烘干刺梨果肉研磨成粉狀移至燒杯中， 加入150 mL無水乙醇。 兩組樣品置于超聲水浴池中， 設(shè)置恒溫40 ℃， 分別于提取時(shí)間0.5， 1， 1.5， 2和2.5 h取上清液待測； 第二組樣品用于與新鮮果肉提取黃酮的FTIR對比。 第三組量取烘干果肉組2.5 h的上清液20 mL， 待無水乙醇揮發(fā)， 取固體待測， 用于與液體中刺梨黃酮的FTIR對比。

超聲結(jié)合酶輔助半仿生法： 取等量新鮮果肉與烘干果肉， 研磨成勻漿和細(xì)粉分別置于兩個燒杯中， 加入60 mL 0.88 g·mL-1的NaCl溶液， 移至容量瓶用0.88 g·mL-1的NaCl溶液定容至120 mL。 設(shè)置三個實(shí)驗(yàn)組， 每組分別量取新鮮果肉與烘干果肉容量瓶中40 mL勻漿液， 胃消化組在水浴溫度達(dá)到37 ℃時(shí)加入0.2 g胃蛋白酶和6 mL水， 最后用1 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為2.0； 胃酸組在37 ℃時(shí)用1 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為2.0； 腸消化組在1 h胃消化后加入模擬腸液(0.15 g胰酶與1.2 g膽汁溶于0.1 mol·L-1的NaHCO3溶液)， 最后用1 mol·L-1NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5。 將三組溶液分別裝入錐形瓶， 在37 ℃避光溫水浴中結(jié)合超聲震蕩消化， 于消化時(shí)間0， 0.5， 1， 1.5， 2和2.5 h取上清液待測， 用于與超聲輔助溶劑萃取法提取的刺梨黃酮的FTIR對比。

2 結(jié)果與討論

2.1 刺梨果肉的紅外光譜

采用紅外顯微鏡(H1000， 德國Bruker儀器有限公司)觀察刺梨果肉的表面形貌， 新鮮刺梨果肉和室溫條件下存放48 h后的刺梨果肉切片表面形貌分別如圖1(a)和(b)所示。 隨著放置時(shí)間的延長， 刺梨果肉表面顏色變黃并變得干癟。

圖1 (a)新鮮刺梨果肉的表面形貌； (b)室溫存放48 h后刺梨果肉的表面形貌

表1 新鮮刺梨果肉(樣品1)與室溫存放48h后刺梨果肉(樣品2)紅外振動

圖2 新鮮刺梨果肉與室溫存放48 h后刺梨果肉紅外光譜

2.2 超聲輔助溶劑萃取法提取的刺梨黃酮的紅外光譜

如圖3(a)和(b)分別為超聲輔助溶劑萃取法新鮮刺梨果肉與烘干果肉樣品的紅外光譜； 圖4中曲線a和b為超聲輔助溶劑萃取法新鮮果肉與烘干果肉樣品的紅外光譜在3 431 cm-1位置處對應(yīng)的透射率強(qiáng)度。 3 431和3 416 cm-1處的吸收峰是O—H伸縮振動； 由圖4透射率強(qiáng)度分析可知， 在相同反應(yīng)條件下， 烘干果肉在1.5 h時(shí)對應(yīng)的透射率強(qiáng)度為83.5%； 而鮮刺梨果肉對應(yīng)的透射率強(qiáng)度為84.0%。 根據(jù)朗伯-比爾定律， 非吸光性溶劑中單一溶質(zhì)的紅外吸收光譜在任一波數(shù)(ν)處的吸光度為

式中，A(ν)和T(ν)分別表示在波數(shù)(ν)處的吸光度和透射率；b表示光程長(樣品厚度)；c表示樣品的濃度。 由朗伯-比爾定律可知， 此時(shí)烘干果肉的吸收強(qiáng)度高于鮮刺梨果肉， 可見烘干果肉所提取的黃酮濃度高于新鮮果肉。 由于樣品量是相同的， 由圖4中曲線a和b可知在反應(yīng)時(shí)間為1.5 h時(shí)達(dá)到最佳提取濃度。 當(dāng)反應(yīng)達(dá)到1.5 h后， 在1.5～2.5 h反應(yīng)時(shí)間段， 樣品中可提取黃酮的量較少。 故， 兩組反應(yīng)物在0～1.5 h的時(shí)間段提取的黃酮物質(zhì)濃度逐漸增加， 在2 h以后有所增加但趨于穩(wěn)定。

圖3 (a)， (b)分別為超聲輔助溶劑萃取法新鮮刺梨果肉與烘干果肉樣品的紅外光譜

圖4 曲線a， b分別為超聲輔助溶劑萃取法新鮮刺梨果肉與烘干果肉樣品的紅外光譜3 431 cm-1位置處對應(yīng)的透射率強(qiáng)度

圖5 (a)和(b)分別為超聲輔助溶劑萃取法所提取黃酮粉末樣品在顯微鏡下的形貌及其紅外光譜圖

2.3 超聲結(jié)合酶輔助半仿生提取的刺梨黃酮的紅外光譜

圖6 (a)， (b)分別為新鮮果肉與烘干果肉超聲結(jié)合酶輔助半仿生法提取樣品的傅里葉紅外光譜圖

圖7曲線a和b分別為新鮮果肉與烘干果肉超聲結(jié)合酶輔助半仿生模擬胃消化樣品的紅外光譜3 419 cm-1位置處對應(yīng)的透射率強(qiáng)度。 由朗伯-比爾定律可知， 隨著提取時(shí)間的延長， 所獲取樣品的紅外光譜吸收峰不斷增強(qiáng)， 說明所提取的黃酮濃度不斷增加， 但在2 h后提取物濃度趨于平穩(wěn)， 說明此時(shí)樣品中的黃酮大部分已被提取出來。 在較低pH模擬胃消化環(huán)境中， 黃酮主要成分之間的基團(tuán)作用力減弱， 從而促進(jìn)黃酮的釋放。 由圖7可知， 在0～1.5 h反應(yīng)時(shí)間段， 新鮮果肉與烘干果肉的透射率強(qiáng)度變化趨勢分別為54%和22%， 由朗伯-比爾定律可知， 新鮮果肉的吸收率強(qiáng)度變化趨勢大于烘干果肉， 表明胃消化環(huán)境下烘干果肉更易于黃酮的快速提取， 此規(guī)律可為開發(fā)刺梨新功能性食品提供思路。

圖7 曲線a和b分別為新鮮果肉與烘干果肉超聲結(jié)合酶輔助半仿生模擬胃消化樣品的紅外光譜3 419 cm-1位置處對應(yīng)的透射率強(qiáng)度

圖8 (a)， (b)分別為新鮮果肉與烘干果肉超聲結(jié)合酶輔助半仿生胃酸模擬提取樣品的傅里葉紅外光譜圖

圖9 (a)， (b)分別為新鮮果肉與烘干果肉超聲結(jié)合酶輔助半仿生腸消化模擬提取樣品的紅外光譜圖

3 結(jié) 論

新鮮野生刺梨果肉與烘干果肉中均含有豐富的黃酮類物質(zhì)， 新鮮果肉中提取黃酮為槲皮素； 室溫存放48 h后刺梨果肉中提取黃酮為山奈酚； 烘干果肉中提取黃酮為山奈酚。 此結(jié)果表明， 可通過分析刺梨黃酮的傅里葉變換紅外光譜特性， 快速鑒識別刺梨黃酮。 由于半仿生法中提取的刺梨黃酮濃度總體增加， 可見刺梨黃酮能在胃腸環(huán)境中提取吸收， 從而野生刺梨可作為健康與功能化食品的原材料。