一種香豆素pH熒光染料的開發(fā)及應用

姜雪琴，劉 禮，李 昊，何陽森，呂沐瀚，吳建明，梁思成，詹會智，齊曉怡

（1.西南醫(yī)科大學 藥學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 胸外科，四川 瀘州 646000）

熒光染料具有良好的發(fā)光特性，被廣泛運用于生物學研究以及疾病診療，例如，蛋白標記、核酸檢測、免疫分析以及水質(zhì)污染物的監(jiān)測等。細胞內(nèi)pH值的變化與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。近年來，基于不同熒光團的pH熒光探針（如姜黃素、半花菁、萘等）已有報道［2－4］。但這些探針存在選擇性較差、Stokes位移小等缺點，導致實際樣品檢測困難［5－7］。

香豆素類化合物是一種以苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)為骨架，具有光學特性突出、生物相容性好等優(yōu)點的化合物，在熒光增白劑［8］、熒光染料［9］和非線性光學材料中應用廣泛［10］。據(jù)報道，在香豆素3位引入苯并咪唑雜環(huán)，能增加分子內(nèi)共軛體系的穩(wěn)定性，使發(fā)射波長紅移、熒光強度增強［11］。而對于細胞內(nèi)pH值的檢測，7-羥基香豆素（pKa=7.50 ）可能為優(yōu)選結(jié)構(gòu)［12］。結(jié)合羥基香豆素和苯并咪唑結(jié)構(gòu)特點，本研究組前期設計合成的一種新型pH探針（3-苯并咪唑-7-羥基香豆素）在pH6.50 ～8.30 范圍內(nèi)具有良好的線性（pKa=7.20 ），可作為一種優(yōu)良的熒光探針，選擇性地感知線粒體pH值的變化［13］。但需要指出的是，線粒體偏弱堿性，其pH值與細胞功能密切相關(guān)，線粒體自噬和細胞凋亡通常與線粒體酸化有關(guān)。例如，與野生型膠質(zhì)細胞相比，帕金森病的膠質(zhì)細胞中線粒體的pH值偏酸性［14］?；诖?，本小組對3-苯并咪唑-7-羥基香豆素進一步改造：根據(jù)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）原理在苯并咪唑基團上引入甲氧基基團，增加電子云密度，降低吸電子能力；同時通過改變體系中分子電荷的轉(zhuǎn)移能力，使探針激發(fā)態(tài)比基態(tài)更具極性。ICT感應探頭羥基對pH值具有高敏感性，可觀察到熒光探針發(fā)生紅移現(xiàn)象［15－16］。本研究合成了一種對pH值敏感的香豆素熒光染料3-（6-甲氧基-1H-苯并咪唑）-7-羥基香豆素（BC），通過熒光和紫外?可見吸收光譜、pKa、探針穩(wěn)定性和選擇性以及熒光成像實驗，明確了探針的熒光屬性，并利用密度泛函理論計算研究了探針的香豆素羰基和苯并咪唑基是否存在激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）過程，為生物醫(yī)學研究和應用奠定了堅實的實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

質(zhì)譜測定采用X500R QTOF－SCIEX高分辨質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司），在Bruker AMX－400（德國BRUKER公司）上獲得1H NMR（400MHz）和13C NMR（100MHz）光譜；18.2 MΩ·cm超純水采用Milli-Q超純水儀（美國MILLIPORE公司）制備；pH值測定使用PHS－3E型精密pH計（中國上海INESA公司）；熒光和紫外－可見吸收光譜測定采用Cytation3細胞成像多功能微孔板檢測儀（美國BIOTEK公司）；細胞成像實驗所用儀器為尼康Ts2R－LS顯微鏡（北京SUNJOY公司）。

2，4-二羥基苯甲醛、氰乙酸乙酯、4-甲苯-1，2-二胺、苯甲酸以及各種金屬離子硝酸鹽購于中國成都科隆化學品有限公司，氨基酸購于成都潤澤本土化工有限公司；丁醇購于廣州文度科學儀器有限公司；乙醇購于上海吉至生化科技有限公司。以上所用試劑均為分析純，如無特殊說明未進一步純化。

1.2 探針BC的合成與表征

將2，4-二羥基苯甲醛（0.56 g，4.0 mmol）、氰乙酸乙酯（0.56 g，5.0 mmol），4-甲苯-1，2-二胺（0.16 g，1.3 mmol）和苯甲酸（0.05 g，0.44 mmol）的混合物分別溶于10mL丁醇中，回流約12h，所得混合物室溫下冷卻，過濾并收集沉淀。沉淀經(jīng)乙醇再結(jié)晶，得到深黃色到淺棕色的固體化合物（BC），真空干燥，得到BC0.37 g，得率98.4 %。BC的1H NMR數(shù)據(jù)為：1H NMR（400MHz，DMSO）：δ12.35（s，1H），8.98 （s，1H），8.36 （s，1H），7.83 ～7.81 （d，J=8Hz，1H），7.55 ～7.53 （d，J=8Hz，1H），7.17 ～7.16 （d，J=4Hz，1H），6.92 ～6.85 （m，3H），3.80 （s，1H）；BC的13C NMR數(shù)據(jù)（ppm）：163.2 、161.8 、160.3 、156.2 、146.7 、143.4 、143.2 、135.1 、131.5 、118.6 、115.2 、113.7 、112.2 、112.1 、108.2 、102.3 、55.8 。HR－MS（ESI）正離子模式下測定化合物（C17H13N2O4+）分子量為309.0805 ，接近理論值309.0813 。熒光探針BC的合成路線如圖1所示。

圖1 3-苯并咪唑-7-羥基香豆素（BHC）和3-（6-甲氧基-1H-苯并咪唑）-7-羥基香豆素（BC）的合成Fig.1 Synthesis of3-benzimidazole-7-hydroxycoumarin（BHC）and3-（6-methoxy-1H-benzimidazole）-7-hydroxycoumarin（BC）

1.3 BC溶液的制備與檢測

將化合物BC溶解于二甲基亞砜（DMSO），超聲處理5min后，配制成探針儲液（20mmol/L），臨用前稀釋成工作溶液。pH值滴定實驗中，采用Britton－Robinson（B－R）緩沖液（由40mmol/L的磷酸、硼酸和醋酸混合而成，實際pH值通過加入一定量的0.2 mol/L氫氧化鈉或鹽酸進行調(diào)節(jié)）將BC儲液稀釋至10μmol/L。此外，所有實驗均在含1% DMSO溶液的條件下進行，測定前將稀釋的BC儲液平衡5min。吸收光譜和熒光光譜在室溫下進行測定，且激發(fā)波長（λex）為420nm，發(fā)射波長（λem）為490nm，狹縫寬度設置為5nm。

1.4 HeLa細胞的培養(yǎng)與成像研究

以HeLa細胞（細胞株由西南醫(yī)科大學藥劑實驗室贈送）為模型，將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素（100U/mL）的改良培養(yǎng)基（DMEM）中，在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞毒性實驗：將細胞接種于96孔板中，24h后加入不同濃度的BC，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，加入CCK－8檢測試劑孵育1h。待指定時間和溫度時，使用酶標儀在450nm波長處測定其吸收值，計算得到BC在不同濃度下的細胞活性值。

細胞成像實驗：將細胞以1.5 ×105個細胞/孔的密度接種在直徑為20mm的圓形玻璃培養(yǎng)皿中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)液后加入含BC的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后棄去培養(yǎng)基并用PBS（pH7.4）清洗細胞3次，采用熒光成像顯微鏡觀察拍照。

1.5 密度泛函理論計算

為了研究化合物BC的香豆素羰基和苯并咪唑基是否存在ESIPT過程，基于已有報道［17］，借助Gaussian09軟件，使用6－31G的B3LYP交換泛函，對其進行密度泛函理論（DFT）計算。優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)滿足局部能量最小。

2 結(jié)果與討論

2.1 BC的熒光性質(zhì)

2.1.1 熒光光譜及紫外－可見吸收光譜香豆素本身無熒光，通過在香豆素環(huán)上引入基團可構(gòu)建推－拉電子體系，如在母核上引入甲氧基－苯并咪唑雜環(huán)會改變咪唑環(huán)電子云密度，導致其發(fā)射波長紅移，熒光強度增強。從BC隨pH值變化的紫外?可見吸收光譜（圖2A）和熒光光譜（圖2B）可以看出，BC的最大紫外吸收峰和發(fā)射峰分別在420nm和490nm處最明顯；在pH10.0 的堿性條件下，BC的最大吸收波長（λabs）位于420nm，發(fā)射波長位于490nm；隨著pH值的降低，420nm處的吸收峰和490nm處的發(fā)射峰明顯降低，且在pH5.5 時達到最低，幾乎觀察不到吸收峰和熒光發(fā)射峰。值得注意的是，在pH值由5.5 升至10.0 的過程中，熒光強度增強了15倍。此外，在偏堿性條件下，Stokes位移明顯增加。說明BC對pH值的變化敏感，有望進一步應用于生物體內(nèi)pH值的變化監(jiān)測。

圖2 BC（10μmol/L）在B－R緩沖溶液中的紫外－可見吸收光譜（A）和熒光光譜（B）Fig.2 UV－Vis absorption spectra（A）and fluorescence spectra（B）of BC（10μmol/L）in B－R buffer solution

2.1.2 pKa的測定線粒體基質(zhì)的pH值呈現(xiàn)堿性（～8.0 ），其pH值的輕微改變將嚴重影響生理機能，關(guān)鍵官能團pKa的測定是研究探針pH值依賴行為的關(guān)鍵。目前已開發(fā)出一些pKa呈弱堿性的熒光探針［18－19］用于線粒體pH值的監(jiān)測。

本研究測定了探針在pH5.5 ～10.0 ，激發(fā)波長為420nm，發(fā)射波長為490nm處的熒光強度。如圖3A所示，對探針在λem=490nm處的熒光強度進行Sigmoidal曲線擬合，并繪制校正曲線。結(jié)果顯示，該探針的pKa值為8.36 ，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9815 。這一良好的線性關(guān)系表明熒光探針的pKa與pH值范圍能很好地匹配，且該探針在pKa附近有可用的、良好的pH值響應范圍（pH7.8 ～9.0 ）。

圖3 BC（10μmol/L）熒光強度隨pH值變化的Sigmoidal擬合曲線（A），BC在pH5.5 和pH10.0 B－R緩沖液中的穩(wěn)定性（B）、可逆熒光變化（C）以及溫度的影響（D）Fig.3 Sigmoidal fitting of the fluorescence intensity for10μmol/L BC（A），as well as stability（B），reversible fluorescence changes（C）of BC in B－R buffer solutions at pH5.5 and pH10.0 ，and effect of temperature（D）

2.1.3 光學穩(wěn)定性與可逆性研究本研究通過監(jiān)測探針2h內(nèi)熒光強度隨時間的變化測定了BC的光學穩(wěn)定性。由圖3B可知，隨著反應時間的增加，檢測體系的熒光信號在pH5.5 和pH10.0 時基本穩(wěn)定，表明該探針的熒光強度不易受外界溶液的干擾。探針的可逆性也是實際應用中的另一個重要因素，進一步監(jiān)測了pH5.5 和pH10.0 時熒光強度的動態(tài)變化。圖3C顯示，在5個循環(huán)中，探針BC在490nm發(fā)射波長處的熒光強度無明顯變化。因此，BC的熒光強度隨時間和pH值波動的變化可以忽略不計，進一步說明該探針是應用于生物樣品熒光強度監(jiān)測的良好選擇。

2.1.4 溫度的影響在實際的樣本檢測中，環(huán)境溫度可能會影響探針熒光強度。為了進一步研究不同溫度對熒光強度穩(wěn)定性的影響，測定了BC在25～45℃范圍內(nèi)的熒光強度。如圖3D所示，熒光強度在pH5.5 和pH10.0 時趨于穩(wěn)定，表明該探針在上述溫度范圍內(nèi)不受影響，且反應可在環(huán)境溫度下進行。

2.1.5 選擇性研究熒光探針可能受到實際生物樣品中存在的各種金屬離子或氨基酸的干擾，而良好的選擇性是熒光探針的一個極其重要的特性［20］。本研究通過檢測探針在最大發(fā)射波長（490nm）處的熒光強度評估其選擇性。從圖4可以看出，pH5.5 和pH10.0 時，金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Fe3+等）、硫醇（GSH、Cys、Hcy）、氨基酸（Tyr、Lys、Glu等）在生理濃度時對BC的熒光強度幾乎無影響，表明該探針對金屬離子和氨基酸具有較好的抗干擾能力。

2.2 細胞活性及熒光成像

為了進一步確定探針在生物體內(nèi)的應用潛質(zhì)，首先采用CCK－8法檢測了BC在HeLa細胞中的體外細胞毒性。研究表明，隨著探針濃度的增加，細胞的活性趨于降低，但BC濃度低于60μmol/L時，細胞的存活率能達到80%以上。因此，根據(jù)細胞毒性實驗結(jié)果，選擇20μmol/L和40μmol/L的BC濃度用于HeLa細胞熒光成像。從圖5中可以清晰看到藍色熒光發(fā)射分散在細胞質(zhì)上，隨著BC濃度和時間的增加，熒光發(fā)射明顯增強，且40μmol/L BC在孵育細胞80min時熒光強度達到最強，較20μmol/L BC在孵育細胞80min時的熒光強度提升了近3倍。結(jié)果表明該探針可成功運用于HeLa細胞標記，且培養(yǎng)濃度和時間會影響B(tài)C的熒光強度。因此，該香豆素有望成為表征生物體內(nèi)pH值變化的熒光染料。

圖5 BC在不同時間和濃度下的熒光成像Fig.5 Fluorescence imagings of BC at different times and concentrations

2.3 BC對pH值敏感的機制

為確定化合物BC的香豆素羰基和苯并咪唑基是否存在ESIPT過程，使用密度泛函理論考察香豆素羰基和苯并咪唑基間氫鍵的影響。圖6結(jié)果顯示，氫鍵的形成對電子云密度無影響。此外，根據(jù)文獻報道，在香豆素上引入苯并咪唑基團可以驅(qū)動分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）［21－24］?；诖耍J為化合物BC對pH值敏感以ICT為主。

圖6 BC的HOMO－LUMO帶隙Fig.6 HOMO－LUMO band gap of BC

3 結(jié) 論

本研究合成了一種以香豆素為母核的pH熒光染料，熒光光譜證明該探針在弱酸性到弱堿性范圍內(nèi)有明顯的熒光強度增強趨勢，具有良好的光穩(wěn)定性和可逆性、抗干擾能力以及較低的細胞毒性。更重要的是，該探針可以成功地應用于標記HeLa細胞，為生物醫(yī)學研究和應用奠定了實驗基礎，有望用于生物成像領(lǐng)域的研究。