基于GC－MS代謝組學(xué)的大鼠肝臟代謝譜時(shí)序性變化的性別差異研究

戴鑫華，向 瑾，常艷波，范瑋豪，楊 虹，楊 林，葉 懿，廖林川*

（1.四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué) 華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041）

死亡時(shí)間（Postmortem interval，PMI）即發(fā)現(xiàn)和檢驗(yàn)尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔［1］。PMI推斷歷來是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。傳統(tǒng)的PMI推斷方法主要依據(jù)死后尸體現(xiàn)象、超生反應(yīng)、胃內(nèi)容物的消化程度、尸體腐敗程度等綜合判斷，但具有一定的主觀性和經(jīng)驗(yàn)性，方法靈敏度較低，整體準(zhǔn)確性不高［2－3］。準(zhǔn)確可靠的PMI推斷仍是法醫(yī)學(xué)研究和實(shí)踐工作中的一大挑戰(zhàn)。

尸體的分解是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。機(jī)體死后由于組織細(xì)胞缺少氧氣，以及超生反應(yīng)、合成代謝的終止和細(xì)胞的自溶及微生物的分解過程，致使全身多組織中代謝物廣泛變化，由脂類、蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)逐漸降解為氨基酸、脂肪酸和核苷酸等小分子代謝物［4］。代謝組學(xué)（Metabolomics/metabonomics）是以生物樣品中分子量＜1000Da的小分子代謝物為研究對象，結(jié)合高通量的檢測技術(shù)，探索生物體內(nèi)代謝物的變化情況［5］。代謝組學(xué)技術(shù)可同時(shí)檢測生物體死后不同時(shí)期的多種小分子代謝物，有助于了解多種代謝物在死后的變化情況，為PMI推斷提供有效信息。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)已逐漸被國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用于PMI推斷研究［6–9］。

雖然現(xiàn)有的基于代謝組學(xué)的PMI推斷研究取得了一定進(jìn)展，但總體來說仍處于探索階段，各種內(nèi)外界影響因素是否會(huì)對死后代謝物變化產(chǎn)生影響，尚不明確。性別是影響尸體腐敗和PMI推斷的內(nèi)源性因素之一，已有研究表明，女性尸體由于皮下脂肪組織更厚，其腐敗速度較男性更快［10］。同時(shí)，生物體內(nèi)部分代謝物水平已被證實(shí)存在性別差異［11－12］，但性別對死后肝臟中代謝物變化的影響尚未見研究報(bào)道。本研究利用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS）代謝組學(xué)技術(shù)，分析不同性別大鼠窒息死后不同時(shí)間肝臟樣本的代謝譜，旨在探索性別差異對肝臟組織代謝物死后變化規(guī)律的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級（無特定病原體，Specific Pathogen Free）SD大鼠72只，雌雄各半，體重（200±20）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5d，自由飲水進(jìn)食。所有實(shí)驗(yàn)均按照四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》。

1.2 儀器與試劑

甲氧胺鹽酸鹽（純度99%）、2-氯-苯丙氨酸（純度98%）均購自北京百靈威科技有限公司，N，O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）（BSTFA+1%TMCS）（純度≥98%）購自北京Solarbio科技有限公司，乙腈（色譜純）購自美國Fisher Chemical公司，乙醚、乙酸乙酯、丙酮和吡啶（分析純）均購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 肟化試劑 精密稱取甲氧胺鹽酸鹽0.20200 g于10mL容量瓶中，加入吡啶溶解并定容至刻度，配成20mg/mL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液精密稱取2-氯-苯丙氨酸0.02550 g于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成2.5 mg/mL2-氯-苯丙氨酸甲醇溶液（母液），于4℃冰箱中保存。使用前將母液用甲醇稀釋成250μg/mL的工作液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及分組36只雌性大鼠和36只雄性大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，建立大鼠機(jī)械性窒息死亡模型。將雄性大鼠和雌性大鼠均隨機(jī)分為死后0、6、12、24、48、72h共6組，每組6只。

1.4.2 樣本采集大鼠于死后立即稱重并以仰臥位置于溫度（25±1）℃、濕度（50±1）%的恒溫恒濕箱中，于死后不同時(shí)間點(diǎn)分別取出大鼠尸體，解剖后分別采集每只大鼠的肝臟右葉，立即放入液氮中冷凍保存，待檢。

1.4.3 樣本前處理稱取肝臟組織樣本約75mg于2mL離心管中，加入3倍重量的生理鹽水，冷凍研磨1min，獲取肝臟組織樣本勻漿液。取勻漿液100μL，加入250μg/mL的2-氯-苯丙氨酸甲醇溶液20μL，渦旋混勻后加入冰乙腈300μL，再渦旋1min后于冷凍離心機(jī)中4℃下以12000r/min離心5min，取100μL上清液，氮?dú)饬飨聯(lián)]干。殘?jiān)尤?0mg/mL肟化試劑30μL，置于80℃烘箱中肟化15min；再加入BSTFA+1% TMCS（硅烷化試劑）30μL，置于80℃烘箱中硅烷化15min；上清液進(jìn)GC－MS分析。

取所有肝臟樣本的乙腈處理液各30μL，混合后制成質(zhì)量控制（Quality control，QC）樣本。QC樣本的處理與肝臟組織樣本相同。

1.4.4 GC－MS實(shí)驗(yàn)條件 色譜條件：色譜柱采用DB－5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min，分流比5∶1，進(jìn)樣口溫度250℃，輔助加熱器溫度230℃；采用梯度升溫，起始溫度60℃，保持1min，以8℃/min升至300℃，保持7min。

社會(huì)認(rèn)知論是社會(huì)心理學(xué)的重要理論之一，與讀心術(shù)有著或多或少的關(guān)系。實(shí)用性利潤重視商品的效用、價(jià)值。感知性利潤重視購買者的自我體驗(yàn)。例如，在兒童節(jié)節(jié)日時(shí)，某廠家品牌的兒童奶粉價(jià)格進(jìn)行8.5折促銷活動(dòng)。當(dāng)那些需求奶粉的購買者看見此品牌價(jià)格促銷進(jìn)行時(shí)，他們通常會(huì)觀察期商品的保質(zhì)期、成分等，并核實(shí)在8.5折之后的奶粉具體價(jià)格，能夠優(yōu)惠多少金錢。倘若此奶粉品牌在贈(zèng)品促銷時(shí)，對買一罐奶粉的購買者都贈(zèng)與兒童玩具，購買者看到可以獲得贈(zèng)品，會(huì)感到非常合適，就會(huì)增加對廠家品牌的認(rèn)可。價(jià)格促銷能提升產(chǎn)品質(zhì)量和價(jià)值本質(zhì)，贈(zèng)品促銷能夠提升額外和驚喜感知。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，溶劑延遲4.5 min，采用電子轟擊電離方式（EI），電離能量為70eV，采用全掃描模式監(jiān)測，全掃描范圍50～600amu。

所有待測樣本均以隨機(jī)順序進(jìn)行檢測分析，每8針實(shí)驗(yàn)樣本之間進(jìn)1針QC樣本，重復(fù)循環(huán)，直至檢測完全部樣本。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析采用XCMS（https：//xcmsonline.scripps.edu）進(jìn)行離子碎片提取、保留時(shí)間校準(zhǔn)、色譜峰對齊等處理。利用NIST2014質(zhì)譜庫（Agilent公司，美國）對色譜峰進(jìn)行定性分析，篩選出匹配度≥80%的代謝物。將每種代謝物的峰強(qiáng)度除以各自樣本的內(nèi)標(biāo)（2-氯-苯丙氨酸）峰強(qiáng)度，計(jì)算得所有代謝物的相對峰強(qiáng)度。

采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）分別對雌性和雄性大鼠不同PMI的肝臟樣本進(jìn)行分析，篩選PMI相關(guān)差異代謝物。差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)為變量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）＞1.0 且Kruskal－Wallis（K－W）檢驗(yàn)值p＜0.05。挑選出不同性別中均與PMI相關(guān)的共同差異代謝物，分析大鼠死后共同差異代謝物的變化趨勢，并利用Studentt檢驗(yàn)比較每種代謝物在不同性別間的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝組學(xué)方法穩(wěn)定性評估

每種組織中的QC樣本是所有該組織樣本的混合，將QC樣本穿插在所有實(shí)驗(yàn)樣本的檢測中，以此評估和驗(yàn)證GC－MS檢測平臺(tái)的穩(wěn)定性［13－14］。雌雄大鼠肝臟組織QC樣本的PCA得分圖見圖1。由圖可知，雌雄大鼠的肝臟QC樣本均較為聚集，表明樣本在檢測時(shí)系統(tǒng)誤差較小，GC－MS檢測平臺(tái)穩(wěn)定性好。

圖1 雌雄大鼠肝臟QC樣本的PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of liver samples of QC samples of male（A）and female（B）rats

2.2 主成分分析

雄性和雌性大鼠死后不同時(shí)間肝臟樣本的PCA得分圖見圖2。如圖所示，雄性大鼠和雌性大鼠各組內(nèi)樣本均分布集中，說明各組樣本組內(nèi)差異均較?。恍坌源笫蠛痛菩源笫蟾鹘M間樣本分離較好，基本無重疊，且均隨PMI升高呈現(xiàn)由左向右的位移趨勢，說明各PMI組間差異均較為顯著，且死后肝臟代謝譜信息可能與PMI呈規(guī)律性變化。

圖2 雌雄大鼠肝臟樣本的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of liver samples of male（A）and female（B）rats

2.3 偏最小二乘法分析

雄性和雌性大鼠死后不同時(shí)間肝臟樣本的PLS得分圖見圖3。如圖所示，在PLS模型中，雄性大鼠和雌性大鼠各組間樣本均能有效區(qū)分。

圖3 雌雄大鼠肝臟樣本的PLS得分圖Fig.3 PLS score plots of liver samples of male（A）and female（B）rats

采用交叉驗(yàn)證和置換驗(yàn)證對PLS模型的有效性和可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。雌雄大鼠肝臟樣本PLS模型的7折交叉驗(yàn)證和200次置換驗(yàn)證結(jié)果見圖4和表1。在交叉驗(yàn)證中，R2和Q2均大于0.5 ，且R2與Q2的差值大于0、小于0.3 ，表明模型擬合較好［15］。在置換驗(yàn)證中，R2在Y軸上的截距小于0.4 且Q2在Y軸上的截距小于0.05 ，表明模型擬合較好，未發(fā)生過擬合［16］。由表1數(shù)據(jù)可知，雄性大鼠和雌性大鼠肝臟樣本PLS模型的交叉驗(yàn)證中R2和Q2均較高，且差值均接近于0；在置換驗(yàn)證中，R2Y均小于0.4 ，Q2Y均小于0.05 。表明雌雄大鼠肝臟樣本的PLS模型均有效可靠，擬合較好，未出現(xiàn)過擬合。

圖4 雌雄大鼠肝臟樣本PLS模型的置換驗(yàn)證圖Fig.4 Permutation results of PLS models of liver samples in male（A）and female（B）rats

2.4 雌雄大鼠死后肝臟的差異代謝物分析

雄性大鼠肝臟中共篩選出42種與PMI相關(guān)的差異代謝物，雌性大鼠肝臟中共篩選出41種與PMI相關(guān)的差異代謝物，雌雄大鼠肝臟中與PMI相關(guān)的共同差異代謝物31種（59.6%），包括氨基酸、脂肪酸、生物胺等生物體內(nèi)的內(nèi)源性代謝物或死后分解代謝產(chǎn)物（圖5）。共同差異代謝物的基本信息、VIP值和p值見表2。

表2 雌雄大鼠肝臟共同差異代謝物匯總表Table2 Summary of common differential metabolites of liver in male and female rats

圖5 雌雄大鼠肝臟樣本中共同差異代謝物的韋恩圖Fig.5 Venn diagram of common differential metabo?lites of liver samples between male and female rats

肝臟、腎臟、腦、心臟和肌肉組織中多種氨基酸水平與PMI的相關(guān)性已被證實(shí)，氨基酸濃度隨PMI延長而逐漸增加［4］。本研究在肝臟組織中也篩選出多種與PMI相關(guān)的氨基酸，與上述研究結(jié)果一致，表明氨基酸水平在死后的變化有望為PMI推斷提供有效信息。脂肪酸是甘油三酯的分解代謝產(chǎn)物，已有研究發(fā)現(xiàn)某些脂肪酸的濃度變化與PMI存在相關(guān)性。Sato等［8］、蔡山青等［17］通過代謝組學(xué)技術(shù)在大鼠血液、脾臟中篩選出月桂酸、油酸和亞油酸等長鏈脂肪酸，可作為PMI特征代謝物；Dai等［18］在敵敵畏中毒死亡大鼠血液中發(fā)現(xiàn)油酸、亞油酸、硬脂酸和軟脂酸的死后濃度變化與PMI呈相關(guān)性。本研究在大鼠肝臟組織中同樣發(fā)現(xiàn)部分長鏈脂肪酸與PMI相關(guān)性較強(qiáng)，如花生四烯酸、二十碳二烯酸、二十二碳六烯酸和油酸等。生物胺類物質(zhì)是蛋白質(zhì)和氨基酸的分解產(chǎn)物，與死后腐敗作用相關(guān)，但其在PMI推斷中的作用存在一定爭議。Vass等［4］在不同組織中檢出多種生物胺類物質(zhì)，但發(fā)現(xiàn)其與PMI之間相關(guān)性不高。然而，最近也有研究發(fā)現(xiàn)，腦組織中的尸胺、腐胺、乙醇胺等生物胺水平與PMI相關(guān)性強(qiáng)，可用于PMI推斷［19－20］。本研究在肝臟組織中檢出尸胺、腐胺、乙醇胺、酪胺和組胺等多種生物胺，發(fā)現(xiàn)其與PMI相關(guān)性較強(qiáng)，能為PMI推斷提供幫助。

Number of princi?pal components Q2 Q2Y Group Male Female 22 Cross validation R2 0.989 0.98 9 0.985 0.98 2 Permutation test R2Y 0.235 0.24 5－0.194－0.18 5

2.5 肝臟中死后代謝物的性別差異

對不同性別大鼠肝臟中31種共同差異代謝物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對濃度進(jìn)行Studentt檢驗(yàn)，比較結(jié)果見圖6。由圖可知，共有18種代謝物在死后不同時(shí)間點(diǎn)存在性別差異。這些性別間存在差異的物質(zhì)可分為2類。第一類是死亡即刻（0h）及后續(xù)時(shí)間點(diǎn)均存在性別差異的代謝物，包括酪醇、L-谷氨酸、花生四烯酸、二十碳二烯酸、甘油酸、磷酸甘油、4-羥基丁酸和α-酮戊二酸。這些物質(zhì)可能在死亡前即存在性別差異，其可能原因?yàn)樾匀旧w的差異和特定基因表達(dá)的差異，也與周期性、差異性的性激素相關(guān)［21］。同時(shí)，外界環(huán)境的刺激（如飲食和運(yùn)動(dòng)等）也會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大性別間的差異［22］。Ruoppolo等［23］研究發(fā)現(xiàn)肝臟和腎臟中大部分氨基酸含量并未表現(xiàn)出性別差異。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在大鼠的肝臟中存在性別差異的氨基酸較少。需要特別注意的是，肝臟組織中花生四烯酸在0h和6h時(shí)存在性別差異，而在6h之后無顯著性差異。這可能是由于肝臟中磷脂的總量在不同性別間的差異不大，但性別的差異可能致使從肝臟磷脂中游離出的花生四烯酸的含量不同，死后隨著肝臟中磷脂分解代謝的逐步進(jìn)行，花生四烯酸在性別間的差異逐漸縮小。第二類是死亡早期性別差異不顯著、死亡24h之后表現(xiàn)出性別差異的代謝物，包括L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-賴氨酸、N-乙酰-賴氨酸、尸胺和腐胺，均為氨基酸和生物胺。這些物質(zhì)均在死后48h和72h出現(xiàn)性別差異，這可能是由于各組織器官中死后微生物群落數(shù)量和種類的性別差異，影響了微生物的分解作用，從而引起組織中多種代謝物濃度的差異［24－25］。

圖6 肝臟中共同差異代謝物在各時(shí)間點(diǎn)的性別差異Fig.6 Gender differences of differential metabolites in liver at different time points

3 結(jié) 論

本研究采用GC－MS對不同性別大鼠死后不同時(shí)間的肝臟組織代謝譜進(jìn)行了分析，篩選出PMI相關(guān)差異代謝物，并比較大鼠死后代謝物變化趨勢的性別差異，發(fā)現(xiàn)了多種存在性別差異的代謝物。研究表明，性別因素會(huì)對死后不同時(shí)間肝臟組織中代謝物的濃度產(chǎn)生影響，采用代謝物推斷PMI時(shí)需考慮性別因素。