一種基于1，4-親核加成反應(yīng)的新型熒光探針及其在食品和活細(xì)胞中的應(yīng)用

張春香，唐斯萍，李雯倩，申有名，谷 標(biāo)*

（1.湖南文理學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，湖南 常德 415000；2.衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，功能金屬有機(jī)化合物湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008）

亞硫酸鹽（SO2?3）是一種強(qiáng)還原劑，廣泛用作食品添加劑，可防止食品氧化和維持食物顏色光鮮亮麗［1］。此外，一定量的亞硫酸鹽會(huì)阻礙微生物正常的生理氧化過程并抑制微生物的增殖［2］。因此，亞硫酸鹽在農(nóng)副產(chǎn)品加工中常被用作防腐劑和漂白劑。研究表明，攝入過量的亞硫酸鹽會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、肺癌及多種神經(jīng)性疾?。?］。鑒于亞硫酸鹽的有害影響，世界衛(wèi)生組織建議人體攝入亞硫酸鹽水平應(yīng)低于0.7 mg/kg［4］。因此，發(fā)展可靠、有效的方法來檢測食品和生物體內(nèi)亞硫酸鹽具有重要意義。

目前已有的亞硫酸鹽檢測方法包括流動(dòng)注射法［5］、電化學(xué)法［6］、毛細(xì)管電泳分析［7］和其他方法［8－9］。然而，這些方法存在操作復(fù)雜、儀器昂貴、侵入性或破壞性檢測等問題，很難用于生物體內(nèi)亞硫酸鹽的檢測。相比之下，熒光探針，特別是具有比色和熒光雙重響應(yīng)的探針，由于觀察方便、樣品預(yù)處理簡單、適用于實(shí)時(shí)監(jiān)測和生物成像分析等優(yōu)點(diǎn)，被視為分析物檢測的有力工具［10－11］。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了許多亞硫酸鹽熒光探針［12－15］。根據(jù)反應(yīng)機(jī)理，主要分為基于氫鍵形成［16］、乙酰丙酸酯的選擇性去保護(hù)［17］和親核加成反應(yīng)［18］的亞硫酸鹽熒光探針3類。盡管報(bào)道的熒光探針在亞硫酸鹽檢測和成像方面取得了一定成就，但仍存在一些問題。例如，基于氫鍵形成機(jī)理的亞硫酸鹽探針容易受到溶劑與亞硫酸鹽之間氫鍵的干擾，在檢測中的選擇性和靈敏性不盡人意［19－20］?；谝阴１狨トケＷo(hù)反應(yīng)機(jī)理的探針被報(bào)道能與水合肼反應(yīng)［21］，產(chǎn)生相同的熒光響應(yīng)，對亞硫酸鹽檢測存在潛在干擾。此外，一些探針檢測時(shí)間長、水溶性差，難以滿足實(shí)時(shí)檢測及生物成像要求［22］。因此，開發(fā)快速響應(yīng)、靈敏性和選擇性高、適于亞硫酸鹽檢測和成像的熒光探針尤為重要。

本研究設(shè)計(jì)并合成了一種新型亞硫酸鹽熒光探針CQ（見圖1）。探針CQ通過乙烯橋鍵將N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段與4-氰基苯乙腈片段連接。其中，N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段不僅能與亞硫酸鹽發(fā)生1，4-親核加成反應(yīng)，作為亞硫酸鹽的特異性識別位點(diǎn)，還能提高整個(gè)探針分子的水溶性。在與亞硫酸鹽作用前，探針CQ內(nèi)具有拉電子性質(zhì)的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽與4-氰基苯乙腈片段形成“拉－拉”電子體系，分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移過程（ICT）受阻，熒光較弱。與亞硫酸鹽作用后，N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段由拉電子性質(zhì)變?yōu)橥齐娮有再|(zhì)，在探針CQ內(nèi)形成“推－拉”電子體系，ICT過程開啟，熒光恢復(fù)。結(jié)果表明探針CQ對亞硫酸鹽識別具有比色和熒光雙重響應(yīng)、反應(yīng)迅速、靈敏性和選擇性高的特點(diǎn)。更重要的是，該探針不僅可用于食品中亞硫酸鹽的定量分析，還可用于HeLa細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽的可視化成像，有望在食品監(jiān)測及生物傳感領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

圖1 探針CQ合成路徑圖Fig.1 Synthesis route of probe CQ

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Bruker AVANCE－400MHz型核磁共振波譜儀（甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)），UV－2600型紫外可見分光光度計(jì)、RF－5301PC型熒光分光光度計(jì)（Shimazu Co，Japan），F(xiàn)luoView FV1200MPE奧林巴斯激光掃描共聚焦顯微鏡。

4-氰基苯乙腈、3-喹啉甲醛、三氟甲基磺酸甲酯和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）購于安耐吉化學(xué)有限公司。其他分析純試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 探針CQ的合成

化合物1的合成與表征：將4-氰基苯乙腈（284.3 mg，2.0 mmol）和3-喹啉甲醛（314.3 mg，2.0 mmol）置于一潔凈的圓底燒瓶（50mL）中，向其中加入哌啶（100μL）和乙醇（20mL），隨后將圓底燒瓶于50℃油浴鍋中攪拌反應(yīng)12h。待反應(yīng)結(jié)束后，有白色固體析出。反應(yīng)混合液經(jīng)過濾、水洗后，得到純凈的化合物1（517.6 mg，92%）。1H NMR（400MHz，DMSO－D6）：δ9.33 （d，J=2.1 Hz，1H），8.96 （d，J=1.5 Hz，1H），8.51 （s，1H），8.11 （t，J=7.7 Hz，2H），8.08－8.00 （m，4H），7.91 （dd，J=11.7 ，4.5 Hz，1H），7.73 （t，J=7.5 Hz，1H）；13C NMR（101MHz，DMSO?D6）：δ151.19 ，148.33 ，143.19 ，138.28 ，136.76 ，133.69 ，132.10 ，129.58 ，129.33 ，128.27 ，127.35 ，127.21 ，118.87 ，117.62 ，112.29 ，111.55 。

探針CQ的合成與表征：將化合物1（281.3 mg，1.0 mmol）和三氟甲基磺酸甲酯（197.0 mg，1.2 mmol）溶解于10mL三氯甲烷中，將混合物室溫下攪拌反應(yīng)12h。待反應(yīng)結(jié)束后，有淡黃色沉淀物質(zhì)生成。經(jīng)過濾、干燥，得到純凈的探針CQ（368.2 mg，83%）。1H NMR（400MHz，DMSO－D6）：δ9.87 （s，1H），9.75 （s，1H），8.61－8.59 （d，J=8.4 ，2H），8.54 （s，1H），8.41－8.37 （m，1H），8.17－8.11 （m，3H），8.06－8.04 （d，J=8.4 ，2H），4.71 （s，3H）；13C NMR（101MHz，DMSOD6）：δ151.35 ，145.45 ，139.44 ，138.56 ，137.30 ，137.19 ，133.95 ，131.62 ，131.33 ，129.09 ，128.07 ，127.47 ，119.99 ，116.53 ，115.57 ，113.20 ，46.50 。

1.3 光譜測試

以色譜純DMF為溶劑，配制濃度為1mmol/L的探針CQ儲(chǔ)備液。以去離子水為溶劑，分別配制濃度為1mmol/L的Na2SO3儲(chǔ)備液和10mmol/L其他干擾物質(zhì)（Zn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Al3+、I－、F－、AcO－、Cl－、N、NO2－、H2PO4－、C－、ClO3－、S2－、SCN－、S－、Hcy、Cys、GSH、N2H4、H2O2、ClO?、S）溶液。樣品溶液的配制：取若干個(gè)2mL的測試管，依次加入20μL CQ儲(chǔ)備液（1mmol/L）、180μL DMF和Na2SO3或者其他干擾物質(zhì)儲(chǔ)備液，用PBS溶液（20mmol/L，pH7.4）定容，放置2min后進(jìn)行光譜測試。

1.4 食品中亞硫酸鹽的檢測

用于實(shí)際樣品分析的白砂糖、石冰糖和紅酒購于附近超市。糖類樣品溶液配制：準(zhǔn)確稱取2.5 g白砂糖和石冰糖，分別用去離子水溶解，定容至10.00 mL。紅酒樣品溶液配制：準(zhǔn)確移取1mL紅酒，用去離子水稀釋，定容至100.00 mL。樣品測試方法：用移液槍準(zhǔn)確移取一定體積的樣品溶液放置在2mL的測試管中，再依次加入20μL CQ儲(chǔ)備液（1mmol/L）和180μL DMF，最后用PBS溶液（20mmol/L，pH 7.4）稀釋至刻度。待樣品溶液孵育2min后，轉(zhuǎn)移至比色皿（1cm）中，通過熒光光譜儀測試其發(fā)射光譜并記錄511nm處的熒光強(qiáng)度。回收率實(shí)驗(yàn)：向樣品溶液中添加不同且已知濃度的Na2SO3標(biāo)準(zhǔn)液（1.0 μmol/L或2.0 μmol/L），利用探針CQ測定加標(biāo)后樣品中亞硫酸鹽的總含量及回收率。

1.5 細(xì)胞成像

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞），稀釋成2.0 ×104cell/mL的細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，使之生長24h。待細(xì)胞貼壁生長后，移除培養(yǎng)基，用溫?zé)幔?7℃）的PBS緩沖液沖洗3次。在細(xì)胞成像之前，首先取一部分HeLa細(xì)胞，放置在含有探針CQ（10μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液（10%小牛胚胎血清的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基）中，使之在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中生長30min。用溫?zé)岬腜BS緩沖液沖洗細(xì)胞外殘留的探針CQ，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞的明場和熒光圖。另取一部分HeLa細(xì)胞與探針CQ（10μmol/L）共孵育30min后，繼續(xù)與Na2SO3（10μmol/L）共孵育5min。經(jīng)PBS緩沖液沖洗后進(jìn)行細(xì)胞成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜表征

在合成探針CQ后，通過紫外－可見吸收光譜儀和熒光光譜儀測試其在PBS溶液（DMF∶H2O=1∶9，體積比，pH7.4）中對亞硫酸鹽的識別性能。如圖2所示，探針CQ在335nm處有一個(gè)紫外吸收峰。加入亞硫酸鹽后，335nm處的吸收峰消失，同時(shí)在442nm處產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)的紫外吸收峰，表明探針CQ與亞硫酸鹽發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成了一種新的物質(zhì)。向探針CQ溶液中加入亞硫酸鹽后，溶液顏色由無色變成黃色。以最大吸收波長335nm為激發(fā)波長測得探針CQ的熒光發(fā)射波長為447nm。采用442nm的激發(fā)波長測定探針CQ的熒光光譜時(shí)，其熒光強(qiáng)度較弱，發(fā)射光譜幾乎呈一條直線；加入亞硫酸鹽后，探針CQ在511nm處出現(xiàn)一個(gè)明顯的發(fā)射峰，其熒光強(qiáng)度增加35倍。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針CQ可作為一種亞硫酸鹽的比色/熒光傳感器。

2.2 反應(yīng)機(jī)理

基于探針CQ與亞硫酸鹽作用前后的紫外及熒光光譜變化，推測探針CQ中的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽與亞硫酸鹽發(fā)生親核加成反應(yīng)，使光譜發(fā)生相應(yīng)變化。為證實(shí)這一猜測，借助核磁共振儀對探針CQ與亞硫酸鹽反應(yīng)前后的氫譜進(jìn)行監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與亞硫酸鹽反應(yīng)后，探針CQ中N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽上的芳?xì)洌∟原子對位的氫）和甲基氫分別向高場移動(dòng)（芳?xì)鋸?.67 移動(dòng)到5.58 ，甲基氫從4.65 移動(dòng)到3.36 ），表明亞硫酸鹽與N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽發(fā)生1，4-邁克爾加成反應(yīng)。因此，提出如下識別機(jī)理（圖4）：具有親核性的亞硫酸鹽通過1，4-邁克爾加成反應(yīng)攻擊探針CQ上的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽片段，生成熒光產(chǎn)物CQ－SO32－。在探針CQ與亞硫酸反應(yīng)后，具有拉電子性質(zhì)的N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽轉(zhuǎn)變成推電子性質(zhì)的片段，與具有拉電子性質(zhì)的4-氰基苯乙腈片段形成“推－拉”電子結(jié)構(gòu)，使分子內(nèi)ICT過程開啟，最終導(dǎo)致紫外和熒光增強(qiáng)，溶液由無色變成黃色。

2.3 條件優(yōu)化

為了準(zhǔn)確檢測亞硫酸鹽，對檢測條件（包括pH值和反應(yīng)時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化。圖5A展示了探針CQ在不同pH值條件下對亞硫酸鹽的熒光響應(yīng)情況。可以看到探針在整個(gè)pH值范圍內(nèi)熒光微弱，熒光強(qiáng)度變化很小，表明探針具有較好的穩(wěn)定性。然而，在加入亞硫酸鹽后，探針溶液在pH6.0 ～10.0 范圍內(nèi)有明顯的熒光增強(qiáng)?？紤]到后續(xù)生物成像應(yīng)用，選擇測試溶液的pH值為7.4。反應(yīng)時(shí)間對亞硫酸鹽檢測的影響如圖5B所示，可以看到探針與亞硫酸鹽混合后，熒光強(qiáng)度迅速增加，并在20s內(nèi)達(dá)到平衡。如此快的反應(yīng)速度使探針能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測亞硫酸鹽。

2.4 靈敏性及選擇性

在PBS溶液（DMF∶H2O=1∶9，體積比，pH7.4）中，控制探針CQ濃度為10μmol/L，通過改變SO32－的濃度（0～10μmol/L），測定體系熒光光譜的變化情況。發(fā)現(xiàn)在探針CQ溶液中加入SO32－后，體系在511nm處的熒光強(qiáng)度（Y）與SO32－的濃度（X，0～10μmol/L）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=74.1148 X+21.7276 ，R2=0.9972 。根據(jù)檢出限（DL）計(jì)算公式（DL=3σ/k，σ為空白樣品連續(xù)測定11次后的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）［23］，得到探針CQ對亞硫酸鹽的檢出限為25nmol/L。

為了考察探針CQ的選擇性，測試了其在不同分析物存在下的熒光光譜。選定的干擾物主要包括一些常見的與環(huán)境和生物相關(guān)的離子（Zn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Al3+、I－、F－、AcO－、Cl－、NO3－、NO2－、H2PO4－、CO32－、ClO3－、S2－、SCN－、SO42－）、水合肼（N2H4）、含巰基的氨基酸（Hcy、Cys、GSH）以及氧化物種（H2O2、ClO－）。由圖6可見，向探針CQ溶液中加入亞硫酸鹽后，511nm處的熒光強(qiáng)度明顯增加，而加入其他分析物質(zhì)后，熒光強(qiáng)度幾乎無變化，表明探針CQ對亞硫酸鹽具有較好的選擇性，可用于亞硫酸鹽的定性和定量分析。

2.5 實(shí)際樣品分析

鑒于探針CQ優(yōu)異的識別性能，進(jìn)一步考察了其檢測實(shí)際樣品中亞硫酸鹽的可行性。3種食物樣品白砂糖、石冰糖和紅酒購于附近超市，經(jīng)預(yù)處理之后，采用標(biāo)準(zhǔn)回收率方法測試樣品溶液中的亞硫酸鹽含量，即：先向樣品溶液中加入不同且已知濃度的Na2SO3標(biāo)準(zhǔn)液（1.0 μmol/L或2.0 μmol/L），測定其熒光光譜，將測得的熒光強(qiáng)度（I511nm）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算亞硫酸鹽含量。分析結(jié)果如表1所示，Na2SO3的加標(biāo)回收率為96.7%～105%，表明探針CQ可用于食品中亞硫酸鹽的定量分析，具有良好的實(shí)用價(jià)值。此外，分別用探針CQ和常規(guī)滴定法測試了樣品溶液中亞硫酸鹽的含量。由于紅酒自身的顏色干擾滴定終點(diǎn)的判斷，所以本實(shí)驗(yàn)選擇襯度高的糖樣品溶液進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，可以看到本方法測得的亞硫酸鹽的濃度與常規(guī)滴定法的測定結(jié)果基本一致，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確性。

表1 食品樣品中Na2SO3的測定Table1 Detection results of Na2SO3in food samples

表2 不同方法測定食品中Na2SO3濃度的結(jié)果Table2 Results for Na2SO3in food samples detected by the probe CQ and direct iodometric method

2.6 細(xì)胞成像

為了探究探針CQ在生物體內(nèi)的潛在應(yīng)用能力，進(jìn)行了細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)HeLa細(xì)胞與探針CQ（10μmol/L）于37℃下共孵育30min后，在熒光顯微鏡下觀察不到任何熒光信號（圖7A下圖）。然而，當(dāng)HeLa細(xì)胞與探針CQ（10μmol/L）共孵育30min，再與Na2SO3（10μmol/L）共孵育5min后，可以觀察到細(xì)胞內(nèi)部有明顯的綠色熒光（圖7B下圖）。說明探針CQ與細(xì)胞內(nèi)的Na2SO3發(fā)生了1，4-邁克爾加成反應(yīng)，釋放熒光信號。通過明場圖（圖7A和7B上圖），可以看到細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，狀態(tài)正常，表明探針CQ具有較好的生物相容性。上述實(shí)驗(yàn)表明探針CQ可用于活細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽的可視化成像。

2.7 與已有探針的比較

將當(dāng)前探針與其他HSO3－/SO32－熒光探針進(jìn)行比較。從表3可知，探針CQ對亞硫酸鹽檢測具有反應(yīng)迅速、水溶性好、靈敏性和選擇性高的特點(diǎn)。這主要是因?yàn)楸狙芯繕?gòu)建的探針是以N-甲基喹啉三氟甲磺酸鹽為亞硫酸鹽的特異性識別位點(diǎn)，不僅能賦予探針較高的選擇性和靈敏性，還能提高整個(gè)探針分子的水溶性。

表3 CQ與其他HSO3－/SO32－熒光探針的比較Table3 The comparison of CQ with other fluorescence probes for HSO3－/SO32－

3 結(jié) 論

本文基于1，4-邁克爾加成反應(yīng)機(jī)理，研制了一種兼具比色和熒光響應(yīng)的亞硫酸鹽探針CQ。該探針對亞硫酸鹽具有響應(yīng)快、靈敏性和選擇性高的特點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用方面，探針CQ不僅可用于食品中亞硫酸鹽的定量分析，還可用于活細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽的熒光成像。因此，本研究為食品樣品和生命系統(tǒng)中亞硫酸鹽的檢測提供了一種有效、方便的工具。