自動(dòng)QuEChERS結(jié)合氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定花生中297種農(nóng)藥殘留

蔣康麗，扈 斌，吳興強(qiáng)，謝瑜杰，李鐵梅，范春林，王明林，王雯雯，陳 輝*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；3.安捷倫科技（中國(guó)）有限公司，北京 100102）

花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，花生出口已成為我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及對(duì)外貿(mào)易的重要產(chǎn)業(yè)［1］。然而由于花生病蟲害、環(huán)境污染、種植方式改變等因素，花生的農(nóng)藥使用量越來越大，農(nóng)藥殘留超標(biāo)嚴(yán)重影響花生品質(zhì)及食用安全，限制了我國(guó)花生出口貿(mào)易的發(fā)展，給我國(guó)經(jīng)濟(jì)帶來不利影響［2］。但花生基質(zhì)成分復(fù)雜，脂肪含量高，同時(shí)含有蛋白質(zhì)、脂肪酸和糖類等成分，如何有效去除基質(zhì)干擾，成為花生等油料作物農(nóng)殘檢測(cè)工作中亟需解決的問題［3－4］。

自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備是一款由自動(dòng)程序控制分析樣品制備的設(shè)備，通過配套試管的聯(lián)合使用（外管提取，內(nèi)管凈化），將樣品提取與凈化整合一體完成，極大提高了樣品的前處理效率［5］。王濟(jì)世等［6］利用自動(dòng)QuEChERS法檢測(cè)玉米中的133種農(nóng)藥殘留，回收率在70%～120%之間；陳婷等［7］利用自動(dòng)QuEChERS法檢測(cè)大米和馬鈴薯中的34種農(nóng)藥殘留，回收率為53.0 %～125%，而利用自動(dòng)QuEChERS檢測(cè)花生中農(nóng)藥多殘留的分析少見報(bào)道。

由于農(nóng)藥大多具有揮發(fā)性和疏水性，故高脂肪樣品多選用氣相色譜進(jìn)行分離，而氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜因具有靈敏度高、選擇性好、定量能力準(zhǔn)確的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留檢測(cè)［8－10］。本研究采用自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備，以PSA/C18/Z－Sep+為分散固相吸附劑，建立了基于QuEChER方法的氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)花生中297種農(nóng)藥的方法。所選取的297種農(nóng)藥包括氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機(jī)氮類、有機(jī)氯類、有機(jī)磷類和有機(jī)硫類等類別，實(shí)現(xiàn)了一種技術(shù)覆蓋多類別農(nóng)藥的檢測(cè)。參考GB2763－2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)－食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中花生最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)所涉及的農(nóng)藥，本文所檢測(cè)的農(nóng)藥數(shù)量多、類別廣，能夠?yàn)橄嚓P(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)［11－12］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent7890A－7000B氣相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；QuEChERS自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)Sio-6512（北京本立科技公司）；自動(dòng)QuEChERS整合管（包括外管和凈化內(nèi)管，北京本立科技公司）；N-112氮吹濃縮儀（美國(guó)Organomation Associates公司），TRIOTM－1N渦旋攪拌器（日本Asone公司），Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司），PL602－L電子天平（瑞士Mettler－Toledo公司），超聲波清洗器（中國(guó)江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

297種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，天津阿爾塔公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）；PSA、C18吸附劑（天津Bonna－Agela公司）；Z－Sep+（美國(guó)Supelco公司）；EMR－lipid（美國(guó)Agilent公司）。實(shí)驗(yàn)用水均為高純水（經(jīng)Milli-Q超純水器純化）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

各稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇準(zhǔn)確定容至刻度，配制成1000mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于－18℃下保存。從1000mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液中各取100μL于10mL棕色容量瓶中，配制成10mg/L的混標(biāo)貯備液，－18℃下保存。按需取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃避光儲(chǔ)存。

1.3 樣品制備與提取凈化

將花生仁用料理機(jī)粉碎，混勻，備用。準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于配套試管的外管中，加入2mL水浸潤(rùn)30min后，加入15mL1%（體積分?jǐn)?shù)）醋酸乙腈、4g硫酸鎂、1g乙酸鈉和12顆鋯珠，將凈化內(nèi)管（內(nèi)管中含100mg PSA，100mg Z－Sep+，200mg C18，400mg無水硫酸鎂和6顆鋯珠）置于外管中，振蕩混勻后放入自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備，設(shè)置提取振蕩程序進(jìn)行處理。待處理完成后，取內(nèi)管上清液2mL，在氮?dú)鈿饬飨麓抵两?，使?mL乙酸乙酯定容，過0.22 μm濾膜，供GC－MS/MS測(cè)定。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

色譜柱：HP－5MS UI氣相色譜柱（30m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）；載氣流速為1.2 mL/min；載氣：氦氣，99.999 %；柱溫：初始溫度40℃，保持1min，以30℃/min升溫至130℃后，再以5℃/min升溫至250℃，最后以10℃/min升溫至300℃，保持8min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；溶劑延遲：4min；EI離子源溫度：270℃；EI源電離能量：70eV；傳輸線溫度：280℃；四極桿溫度：150℃；碰撞氣：高純氮?dú)猓?9.999%）；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。檢測(cè)離子對(duì)及掃描時(shí)間見表1，297種農(nóng)藥殘留的總離子流圖見圖1。

圖1 花生中297種農(nóng)藥的總離子流圖（0.1 mg/kg）Fig.1 Total ion chromatogram of297pesticides（0.1 mg/kg）in peanut

表1 297種農(nóng)藥的保留時(shí)間、MRM參數(shù)、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）、花生基質(zhì)的加標(biāo)回收率（100μg/kg）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs，n=6）及定量下限（LOQ）Table1 Retention times，MRM parameters，linear ranges，correlation coefficients（r2），recoveries（100μg/kg）and RSDs（n=6），and limits of quantitation（LOQs）of297pesticides

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

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（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑種類優(yōu)化花生基質(zhì)成分復(fù)雜，提取劑在保證目標(biāo)農(nóng)藥提取效率的同時(shí)應(yīng)盡可能減少共萃物的萃取，減少基質(zhì)干擾。乙腈通用性強(qiáng)，滲透性好，能有效降低油脂蛋白質(zhì)和糖分的干擾［13］，已成為應(yīng)用廣泛的農(nóng)藥多殘留提取劑。在乙腈作用下，某些堿敏感型農(nóng)藥易發(fā)生降解［14］，因此需在乙腈中加入適量醋酸調(diào)節(jié)pH值。本文考察了純乙腈、1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）醋酸乙腈和2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）醋酸乙腈對(duì)花生中目標(biāo)農(nóng)藥的提取效率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以1%醋酸乙腈為提取劑時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍的數(shù)量高于乙腈和2%醋酸乙腈（圖2），因此本實(shí)驗(yàn)選擇1%醋酸乙腈作為提取試劑。

圖2 目標(biāo)農(nóng)藥在3種不同提取劑中的回收率Fig.2 Recoveries of target pesticides with three different extract solvents

2.1.2 提取溶劑用量?jī)?yōu)化提取劑的用量會(huì)對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的回收率造成一定影響。本文分別比較了1%醋酸乙腈用量為10、15、20mL時(shí)，花生中目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率情況。結(jié)果表明，用量為15mL和20mL時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍內(nèi)的占比分別為74.5 %和72.5 %，均高于10mL時(shí)的占比（70.2 %）。最終選擇1%醋酸乙腈的體積為15mL進(jìn)行提取。

2.2 緩沖鹽用量的優(yōu)化

由于花生大多為干制品，水分含量較低，用1%醋酸乙腈提取時(shí)，不能很好地滲透到樣品組織內(nèi)部，導(dǎo)致部分農(nóng)藥回收率較低。因此，在提取過程中通常會(huì)加入一定量的水，但水分過多影響凈化效果，且可能對(duì)儀器產(chǎn)生損害，而加入緩沖鹽可以起到使水相與有機(jī)相分離并去除水分的作用。本文考察了2g硫酸鎂+0.5 g乙酸鈉、4g硫酸鎂+1g乙酸鈉和6g硫酸鎂+1.5 g乙酸鈉3種緩沖鹽方案對(duì)花生中297種農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響。

結(jié)果表明，使用2g硫酸鎂+0.5 g乙酸鈉時(shí)，樣品與鹽結(jié)合成團(tuán)狀，不能充分去除樣品中水分，影響目標(biāo)化合物的提取，且只有52.7 %的目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%；使用6g硫酸鎂+1.5 g乙酸鈉時(shí)，65.7 %的目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%；而使用4g硫酸鎂+1g乙酸鈉時(shí)，有83.0 %的農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍，較其它兩種組合回收率提高了30.3 %和17.3 %，因此選擇4g硫酸鎂+1g乙酸鈉作為緩沖鹽。

2.3 凈化劑的優(yōu)化

2.3.1 凈化劑種類的優(yōu)化Z－Sep+是二氧化硅鍵合C18和ZrO2兩種吸附劑的混合物，在酸性條件下，對(duì)帶有負(fù)電荷的油酸、羧酸等陰離子具有很強(qiáng)的吸附作用，除油脂效果更理想［15］。另外，作為一種與Z－Sep+功能相似的吸附劑，增強(qiáng)型脂質(zhì)吸附劑（EMR－lipid）可通過體積排阻與疏水作用將基質(zhì)中體積較大且疏水的油脂類化合物分離，從而達(dá)到較好的凈化效果［16－17］。

本文以1%醋酸乙腈為提取劑，在固定加入400mg無水硫酸鎂的前提下［7，18］，考察了4種凈化劑組合的凈化效果：（1）100mg PSA+200mg C18；（2）100mg PSA+100mg Z－Sep+；（3）100mg PSA+150mg C18+75mg Z－Sep+；（4）EMR－lipid。

4種凈化劑組合中目標(biāo)農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍的比例依次為56.2 %、68.2 %、77.1 %和69.6 %，即使用組合（3）時(shí)回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)最多。在100μg/kg添加水平下，將上述各凈化劑組合樣品同批次進(jìn)樣并進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)加入C18和Z－Sep+時(shí)化合物響應(yīng)明顯高于其他組合。以氯氟氰菊酯、α-六六六為例，其提取離子流色譜圖如圖3所示。因此選擇100mg PSA+150mg C18+75mg Z－Sep+為最優(yōu)凈化劑組合。

圖3 不同凈化劑組合下氯氟氰菊酯、α-六六六在花生中的提取離子流色譜圖Fig.3 Overlapped extract ion chromatograms of cyhalothrin and α-HCH in peanut sample after cleanup using different sorbents

2.3.2 凈化劑用量的優(yōu)化采用單因素實(shí)驗(yàn)法進(jìn)一步優(yōu)化了C18、Z－Sep+和PSA的添加量。固定加入400mg無水硫酸鎂，分別比較了C18（100、200、300、400mg）、Z－Sep+（50、75、100、125mg）和PSA（50、100、150、200mg）添加量對(duì)農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用100mg PSA、200mg C18和100mg Z－Sep+時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥的回收效果最好。因此，本研究最終采用100mg PSA+200mg C18+100mg Z－Sep+為凈化劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指基質(zhì)引起的檢測(cè)信號(hào)的增強(qiáng)或者減弱現(xiàn)象，不同農(nóng)藥所受到的基質(zhì)效應(yīng)不同。本研究通過建立一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式ME（%）=100%×（A－B）/B（A為農(nóng)藥在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)值，B為農(nóng)藥在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值）進(jìn)行計(jì)算和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)。ME低于－20%時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，在－20%～20%之間時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；大于20%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)［19］。由圖4可見，共有6種（2.02 %）農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)抑制，216種（72.73 %）農(nóng)藥表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，75種（25.25%）農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)。因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，以減弱基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物定量的影響。

圖4 花生中目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects（ME）of the test pesticides in peanut matrix

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 定量下限在最佳條件下，采用花生的空白基質(zhì)溶液，準(zhǔn)確配制0.6 ～50μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在GC－MS/MS上進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到297種農(nóng)藥的線性回歸方程。各農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量下限（S/N=10）結(jié)果見表1。從表中可以看出，各農(nóng)藥在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.995 ，定量下限為2～10μg/kg。

2.5.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選擇花生空白樣品，分別進(jìn)行10、20、50、100μg/kg4個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣品。其平均回收率分別為72.7 %～116%、71.9 %～117%、73.2 %～112%和71.5 %～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）分別為0.90 %～15%、0.70 %～15%、0.60 %～14%和0.40 %～15%，滿足農(nóng)藥多殘留分析的要求。100μg/kg加標(biāo)水平的數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用所建立的方法對(duì)市售8批次花生樣品進(jìn)行檢測(cè)，共6批次檢出農(nóng)藥殘留（表2），其中第2批次樣品檢出9種農(nóng)藥，為檢出農(nóng)藥殘留最多的批次，其總離子流圖見圖5。所有樣品中共檢出17種農(nóng)藥殘留，且百治磷、咪鮮胺和唑禾草靈的檢出頻次較高?？傮w而言，花生中的農(nóng)藥整體殘留水平較低。

圖5 檢出9種農(nóng)藥的花生樣品的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of peanut samples with9pesticides detected No.were the same as those in Table1

表2 花生中農(nóng)藥檢出情況Table2 Detection results of pesticide residues in peanut

(續(xù)表2)

3 結(jié) 論

本文在QuEChERS的基礎(chǔ)上對(duì)提取和凈化步驟進(jìn)行優(yōu)化，聯(lián)合PSA、C18和Z－Sep+進(jìn)行凈化，顯著提高了回收率，并將QuEChERS方法與自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備結(jié)合，極大地提高了工作效率。與傳統(tǒng)QuEChERS方法相比較，本方法在保證回收率與精密度的基礎(chǔ)上，自動(dòng)化程度更高，處理批量樣品的耗時(shí)更短，為快速測(cè)定花生中的多農(nóng)藥殘留提供了有力的技術(shù)手段。