基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鶴蟾片治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制研究

陳志輝， 周銳， 唐瑩， 周岱翰

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510405

在全世界范圍內(nèi)，惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一，因其具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率等特點(diǎn)而備受關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增癌癥患者1 810萬(wàn)，我國(guó)占380.4萬(wàn)例，其中肺癌的發(fā)病率為11.8%，病死率為18.4%[1]。而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC）約占了所有類型肺癌的80%，且五年生存率低于10%[2]。目前NSCLC的治療主要有手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療、免疫治療和中醫(yī)藥治療等。其中，中醫(yī)藥在治療NSCLC方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，除了可延長(zhǎng)患者生存期，還可減少放化療和分子靶向治療的毒副反應(yīng)[3-4]。

鶴蟾片是國(guó)醫(yī)大師周岱翰教授的經(jīng)驗(yàn)方，有多年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。鶴蟾片主要由仙鶴草、干蟾皮、半夏、天冬、浙貝母、貓爪草、葶藶子、魚(yú)腥草、人參組成，方中干蟾皮清熱解毒，利水消脹；仙鶴草補(bǔ)虛止血；半夏、貓爪草、浙貝母化痰散結(jié)；魚(yú)腥草清熱解毒，消癰排膿；葶藶子瀉肺平喘，利水消腫；天冬養(yǎng)陰潤(rùn)燥，清肺生津；人參大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)脾益肺，全方配伍，具有解毒除痰、凉血養(yǎng)陰、消癥散結(jié)等功效，用于治療原發(fā)性支氣管肺癌及肺部轉(zhuǎn)移[5]。目前已有多項(xiàng)研究表明，鶴蟾片具有抑瘤作用。周岱翰等[5]用鶴蟾片治療102例晚期肺癌患者(單服鶴蟾片組62例，手術(shù)治療配合鶴蟾片組31例，化療配合鶴蟾片組9例）。其中單服鶴蟾片組，顯效6例，有效33例，總體有效率為62.9%，平均生存時(shí)間7.66個(gè)月；手術(shù)治療配合鶴蟾片組有效26例，平均生存時(shí)間9.1個(gè)月；化療配合鶴蟾片組顯效1例，有效4例，平均生存時(shí)間6.1個(gè)月。鶴蟾片對(duì)于肺癌的治療具有較好的臨床療效，而此次的研究也獲得了全國(guó)中醫(yī)藥重大科技成果乙等獎(jiǎng)。熊紹權(quán)等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鶴蟾片含藥血清對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，并證實(shí)為通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，其分子機(jī)制可能與抑制EGFR基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點(diǎn)-非小細(xì)胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合生物學(xué)信息分析，探索更多有關(guān)鶴蟾片治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 鶴蟾片化學(xué)成分收集與篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）尋找鶴蟾片(仙鶴草、干蟾皮、半夏、天冬、浙貝母、貓爪草、葶藶子、魚(yú)腥草、人參）9味中藥化學(xué)組成成分，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性(drug likeness，DL）≥ 0.18的2個(gè)體外藥代幼力學(xué)屬性值進(jìn)行活性成分的初步篩選，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性成分。

1.2 中藥活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與共同靶點(diǎn)篩選

通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取中藥活性成分的結(jié)構(gòu)，將其2D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式。將活性成分結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.swisstargetprediction.ch）中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，以獲取活性成分的靶點(diǎn)。其中把Probability＜0.1的靶點(diǎn)及未能預(yù)測(cè)到的活性成分進(jìn)行剔除。

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org）檢索“非小細(xì)胞肺癌”靶點(diǎn)，以Score值為條件獲取疾病靶點(diǎn)。將中藥活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌疾病靶點(diǎn)取交集，獲得成分-疾病共同靶點(diǎn)。之后使用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點(diǎn)-非小細(xì)胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)，篩選出主要活性成分。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)提交至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org）構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(＞0.9），其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2進(jìn)行可視化，并使用Network Analyzer功能計(jì)算Degree值，根據(jù)Degree值篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 GO功能富集與KEGG通路富集

使用R軟件3.6.2中的“clusterProfiler”包對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，包括基因本體論(gene ontology，GO）和生物學(xué)通路(biological pathway）富集分析，使用Bonferroni檢驗(yàn)法校正P值，并設(shè)定P＜0.05，篩選出具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 鶴蟾片活性成分的篩選及靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道檢索鶴蟾片的活性成分，其中仙鶴草41個(gè)，干蟾皮30個(gè)，半夏116個(gè)，天冬32個(gè)，浙貝母17個(gè)，貓爪草79個(gè)，葶藶子68個(gè)，魚(yú)腥草50個(gè)，人參190個(gè)。根據(jù)ADME篩選后獲得活性成分共99個(gè)，其中仙鶴草5個(gè)，干蟾皮12個(gè)，半夏13個(gè)，天冬9個(gè)，浙貝母7個(gè)，貓爪草12個(gè)，葶藶子12個(gè)，魚(yú)腥草7個(gè)，人參22個(gè)。將99個(gè)中藥活性成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，剔除無(wú)法獲得結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)種類不明確的活性成分，最終得到活性成分72個(gè)，其中仙鶴草4個(gè)，干蟾皮8個(gè)，半夏12個(gè)，天冬6個(gè)，浙貝母6個(gè)，貓爪草8個(gè)，葶藶子9個(gè)，魚(yú)腥草5個(gè)，人參14個(gè)(見(jiàn)表1）。將72個(gè)活性成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)3 233個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，得到活性成分靶點(diǎn)772個(gè)。

表1 鶴蟾片的活性成分Table 1 Active components of He Chan Tablets

2.2 非小細(xì)胞肺癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到非小細(xì)胞肺癌相關(guān)靶點(diǎn)共計(jì)19 240個(gè)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，若靶點(diǎn)過(guò)多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為非小細(xì)胞肺癌的潛在靶點(diǎn)。因此選取Score≥37.16的1 204個(gè)靶點(diǎn)作為非小細(xì)胞肺癌的潛在靶點(diǎn)。

2.3 鶴蟾片活性成分-非小細(xì)胞肺癌共同靶點(diǎn)的獲取

將篩選的772個(gè)鶴蟾片活性成分靶點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌的1 204個(gè)靶點(diǎn)取交集，得到交集靶點(diǎn)228個(gè)(見(jiàn)圖1）。將72個(gè)鶴蟾片活性成分與228個(gè)潛在靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點(diǎn)-非小細(xì)胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2），經(jīng)過(guò)NetworkAnalyzer網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊螅贸龆戎?Degree）最高的5個(gè)活性成分(見(jiàn)表2），這5個(gè)成分可能是鶴蟾片治療NSCLC的主要活性成分。

圖1 鶴蟾片活性成分靶點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)韋恩圖Figure 1 Venn Diagram of relationship between active components targets of HeChan Tablets and NSCLC potential targets

圖2 鶴蟾片活性成分-非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The “compound-target-disease” network of HeChan tablets and NSCLC.（The blue nodes represent the active components of HeChan tablets；The green nodes represent potential targets；The red nodes represent HeChan tablets；The size of the nodes represent the degree）

表2 鶴蟾片度值排名前5的主要活性成分Table 2 The main five active components of He Chan Tablets

2.4 核心靶點(diǎn)的篩選及可視化

將228個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其相互作用的蛋白，得到216個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中SCN9A、 PLA2G2A、 P2RX7、 HNF4A、 GBA、TYR、HPGD、ANPEP、ROS1、MIF、CHRNA3、NQO2無(wú)相互作用，故剔除），1574條邊，置信度≥0.90的PPI網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape 3.8.2進(jìn)行篩選核心靶點(diǎn)及可視化，使用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治龊螅詃egree≥9為篩選條件，最終獲得116個(gè)核心靶點(diǎn)和1 513條邊(見(jiàn)圖3）。度值排名前10的核心靶點(diǎn)見(jiàn)表3。

表3 度值排名前10的核心靶點(diǎn)Table 3 The main potential targets of HeChan Tablets

圖3 鶴蟾片-非小細(xì)胞肺癌核心靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The PPI network of the main potential targets between HeChan tablets and NSCLC.（The size of the nodes represent the degree；The colour represent the betweenness centrality）

2.5 核心靶點(diǎn)的富集分析

使用R軟件中的clusterProfiler包對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。GO分析包括分子功能(Molecular Function， MF）、 生 物 過(guò) 程(Biological Process，BP）、和細(xì)胞組成(Cellular Component，CC）三個(gè)部分，結(jié)果見(jiàn)圖5。MF富集結(jié)果顯示：核心靶點(diǎn)主要涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、激素受體結(jié)合等功能；BP富集結(jié)果顯示：核心靶點(diǎn)主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白激酶B信號(hào)、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程；CC富集結(jié)果顯示：核心靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞膜、神經(jīng)元胞體、黏著斑、蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等細(xì)胞成分。根據(jù)核心靶點(diǎn)通路的富集分析結(jié)果，主要涉及的通路有：PI3K-AKT信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、非小細(xì)胞肺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、前列腺癌、胰腺癌等通路(見(jiàn)圖4）。

圖4 核心靶點(diǎn)的富集分析結(jié)果（注：A：GO-MF分析；B：GO-BP分析；C：GO-CC分析；D：KEGG分析）Figure 4 Result of the GO enrichment analysis（A：GO-Molecular Function；B：GO-Biological Process；C：GO-Cellular Component；D：KEGG pathway）

3 討論

古代并無(wú)肺癌病名，文獻(xiàn)中關(guān)于“咳嗽”“肺痿”“痰飲”“肺積”“息賁”等病證的描述與肺癌具有高度相似性。周岱翰教授在多年的臨床實(shí)踐過(guò)程中，認(rèn)為肺癌的辨證不離“痰”“瘀”“虛”“毒”四個(gè)方面。病機(jī)特點(diǎn)總屬“本虛標(biāo)實(shí)”，本虛以肺脾兩虛多見(jiàn)，久病入絡(luò)，病久及腎，標(biāo)實(shí)則痰瘀互結(jié)常見(jiàn)。根據(jù)肺癌的發(fā)病特點(diǎn)將肺癌分為肺郁痰瘀、脾虛痰濕、陰虛痰熱、氣陰兩虛4種證型。鶴蟾片全方配伍，具有解毒除痰、凉血養(yǎng)陰、消癥散結(jié)的功效，切中肺癌“痰”“瘀”“虛”“毒”的辨證特點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)觀點(diǎn)從系統(tǒng)水平識(shí)別“疾病-表型-基因-藥物”的多層次關(guān)系，體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑作用的特征，符合中醫(yī)藥整體觀及組方配伍原則，是中藥研究和新藥發(fā)掘的一種新方法[7]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“鶴蟾片-活性成分-靶點(diǎn)-非小細(xì)胞肺癌”網(wǎng)絡(luò)，得出鶴蟾片的5個(gè)主要活性成分為：黃芩素(baicalein）、槲皮素(quercetin）、異鼠李素(isorhamnetin）、山柰酚(kaempferol）、五味子酯乙(Gomisin B）。黃芩素屬于黃酮類化合物，研究表明黃芩素具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、抗血栓形成、抗腫瘤和保護(hù)肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等作用[8-13]。而黃芩素在非小細(xì)胞肺癌方面，主要是通過(guò)細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡相關(guān)蛋白及通路、血管生成、上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤微環(huán)境、抗氧化等多方面調(diào)控NSCLC細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、化療敏感性等生物學(xué)行為，具有廣泛的抗腫瘤作用[14]。鶴蟾片中的仙鶴草、魚(yú)腥草、葶藶子、天冬都含有槲皮素，研究表明槲皮素具有明顯的抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與STAT3信號(hào)通路的抑制有關(guān)[15]。羅進(jìn)勇等[16]發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白p53表達(dá)和下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。朱玲等[17]進(jìn)行體內(nèi)外研究結(jié)果表明異鼠李素可下調(diào)bcl-2基因、PCNA蛋白表達(dá)，上調(diào)抑癌基因P53，bax及caspase-3基因，抑制人體肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)。張敬等[18]發(fā)現(xiàn)山柰酚可通過(guò)抑制雌激素受體相關(guān)受體發(fā)揮降低非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移能力。劉小東等[19]發(fā)現(xiàn)五味子酯乙能高效逆轉(zhuǎn)肺癌耐紫杉醇A549/Tax細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐藥性，其機(jī)制可能與抑制P糖蛋白的藥物外排功能和下調(diào)其蛋白表達(dá)有關(guān)。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，本研究的核心靶點(diǎn)為PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、AKT1、SRC 等。而根據(jù)KEGG富集分析結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號(hào)通路為主要通路，其次為癌癥中的蛋白多糖、前列腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等通路。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是一種可催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的脂類激酶，在PI3K家族中，研究最廣泛的是能被細(xì)胞表面受體所激活的Ⅰ型PI3K。IA型PI3K是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85所組成的二聚體蛋白，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性[20]。PIK3R1基因編碼表達(dá)PI3K的調(diào)節(jié)亞單位p85，而PIK3CA基因編碼表達(dá)PI3K的催化亞單位p110。研究表明[21]PI3K在非小細(xì)胞肺癌發(fā)展中起重要作用，當(dāng)PIK3CA基因突變可導(dǎo)致p110α酶活性增強(qiáng)、激活A(yù)KT信號(hào)、減少細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴、抑制細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)腫瘤的侵襲。Akt基因是一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶，又被稱為蛋白激酶B，是PI3K下游的作用靶點(diǎn)[20]。研究表明[22]AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路的核心，激活狀態(tài)的AKT表達(dá)升高被證實(shí)存在于43%～90%的NSCLC病例中，而且激活狀態(tài)的AKT表達(dá)于早期的原發(fā)性腫瘤中的患者往往預(yù)后差，且AKT的過(guò)度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。PI3K/AKT通路是NSCLC最常見(jiàn)的調(diào)控途徑之一，其對(duì)癌細(xì)胞的生存以及疾病的發(fā)生發(fā)展都至關(guān)重要，包括腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)血管生成和化療耐藥等都與PI3K/AKT通路相關(guān)[23]。因此阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路有可能抑制NSCLC的生存途徑并誘導(dǎo)其凋亡。此外，研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）的過(guò)度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[24]。張潔等[25]發(fā)現(xiàn)Src作為胞漿內(nèi)蛋白，能與細(xì)胞膜上的許多生長(zhǎng)因子受體相互作用，進(jìn)而激活Src蛋白。激活的Src蛋白使其下游信號(hào)發(fā)生瀑布效應(yīng)，通過(guò)組織MAPK以及STAT3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[26]。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了鶴蟾片治療非小細(xì)胞肺癌的主要活性成分、核心靶點(diǎn)、信號(hào)通路，揭示鶴蟾片是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同發(fā)揮藥理作用。但限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的局限性，本研究結(jié)果可能出現(xiàn)藥物活性成分及潛在靶點(diǎn)收集不全、或數(shù)據(jù)庫(kù)信息未能及時(shí)更新所致研究結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題，后續(xù)仍需通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以佐證。